El uso de la saliva como muestra biológica tiene muchas ventajas, principalmente relacionadas con su obtención ya que es procedimiento no invasivo, fácil y que no genera dolor.
Además, se pueden obtener muestras repetidas en cualquier momento y lugar, y sin necesidad de personal especializado. Por lo tanto, es muy adecuada para fines de monitorización y tiene muchas aplicaciones potenciales tanto en el campo veterinario como en el humano.
Estas ventajas son especialmente relevantes en cerdos, donde la extracción de sangre es altamente estresante, tanto para el animal como para el personal encargado de la toma de muestras.
Por lo tanto, el uso de saliva en esta especie puede ser muy apropiado. El personal puede tomar fácilmente las muestras, lo que permite realizar análisis más frecuentes y controlar mejor la salud y el bienestar (imagen 1).
Recientemente se ha publicado una revisión sobre la utilización de la saliva para la detección de patógenos en cerdos. Según esta publicación, se pueden detectar más de 23 patógenos virales en la saliva porcina, y actualmente la detección de enfermedades infecciosas es posiblemente el principal uso de la saliva en la práctica rutinaria en esta especie.
Sin embargo, también puede ser utilizada para evaluar otros aspectos relacionados con la salud y el bienestar porcino que pueden ser de interés, como la evaluación del estrés, la inflamación, la respuesta inmune y el equilibrio redox.
En este artículo se desarrollará la base fisiológica e interpretación de la acción de biomarcadores que pueden utilizarse para detectar y evaluar el estrés en cerdos.
Además, se incluirán algunas normas generales relativas a la toma de muestras y el almacenamiento de la saliva.
EVALUACIÓN DEL ESTRÉS
Cortisol
Actualmente, el cortisol es, posiblemente, el biomarcador más utilizado para detectar el estrés en cerdos. Cuando se produce una situación de estrés, se activa el eje Hipotálamo – Pituitario – Adrenal (HPA) a partir de la cual se produce cortisol que se libera en la sangre.
En la sangre, el cortisol está presente en dos fracciones:
- unido a proteínas y
- libre;
mientras que en la saliva sólo hay cortisol libre, que es la fracción activa. El paso del cortisol libre de la sangre a la saliva se produce por difusión pasiva de la molécula a la glándula salival.
Debe tenerse en cuenta que existe variabilidad en los rangos de referencia reportados en la literatura para este metabolito en animales no estresados y una alta variación intraindividual.
También es importante indicar que las concentraciones de cortisol siguen un ritmo circadiano en saliva, que puede variar con la edad y el sexo. La variabilidad entre animales puede alcanzar un coeficiente de variación del cortisol del 62% en la saliva de animales no estresados.
Por lo tanto, sería recomendable comparar las concentraciones de cortisol en un individuo con los valores obtenidos con el mismo ensayo e, idealmente, en el mismo animal o grupo de animales con condiciones similares de edad, raza y sexo y sin signos evidentes de estrés.
Alfa-amilasa salival (sAA) y cromogranina-a (CgA)
Estos biomarcadores son producidos directamente por la estimulación de las glándulas salivales por el sistema nervioso autónomo (SNA).
Ambos analitos pueden aumentar en situaciones de estrés agudo. Al igual que el cortisol, la variabilidad individual es amplia.
En esta línea, la sAA puede aumentar desde valores inferiores a 100 UI/L hasta superiores a 1000 UI/L, llegando algunos individuos hasta 4000 UI/L, en el momento de la inducción del estrés en algunos cerdos, mientras que en otros cerdos no cambia.
También, se ha observado que la CgA se multiplica por 1,2 tras 10 minutos de inmovilización continua y que pasa de valores inferiores a 2 mg/L – 3 mg/L tras 15 minutos de cese de la inmovilización.
En un modelo de restricción por encierro en una jaula durante 60 min, el aumento de CgA fue superior a 4 veces y persistió aumentado 2-3 veces a los 30 min de cesar el estímulo. Esto podría indicar una posible relación de este marcador con el estrés de mayor duración.
Aunque ambos biomarcadores están relacionados con el SNA, y por tanto con la reacción que se produce tras un estrés agudo, se han descrito cambios en CgA y sAA en situaciones de estrés de mayor duración, por ejemplo:
- sAA mostró aumentos en cerdos que sufrían dolor por cojera y prolapso rectal. Los animales con estos trastornos mostraron aumentos aún mayores de sAA (7,49 veces y 18,20 veces en los casos más graves de cojera y prolapso, respectivamente, en comparación con los animales sanos) que de otros biomarcadores como el cortisol (1,72 veces y 2,30 veces en los animales cojos y con prolapso, respectivamente).
Aunque no se conoce bien el mecanismo, la CgA disminuyó en la saliva tras diferentes tipos de enriquecimiento ambiental y suplementación con hierbas durante 2 meses en cerdos en crecimiento, desde valores de 1 mg/L a valores inferiores a 0,3 mg/L.
Esto podría indicar una reducción del estrés de estos cerdos durante este periodo. Además, la CgA en saliva mostró una correlación de baja a moderada, pero significativa, con la concentración de cortisol en pelo.
Además, la CgA es un biomarcador temprano del síndrome de disgalactia postparto (SDP). Este biomarcador se incrementó significativamente en cerdas con SDP antes del parto, mostrando una mayor sensibilidad que otros marcadores como el cortisol.
Aunque se desconoce la razón de este aumento, los valores elevados de CgA podrían indicar una situación de estrés con activación del sistema adrenérgico que podría estar implicado en la patogénesis de esta enfermedad.
Además, podría existir un papel de la CgA en los trastornos gastrointestinales asociados al SDP, ya que, en el tracto gastrointestinal humano, la CgA es liberada por las células enterocromafines y las neuronas de los ganglios submucosos y mientéricos, y podría modular la motilidad colónica en respuesta a la inflamación.
Actividad de la esterasa total (TEA) y sus componentes saliva
La TEA es abundante en la saliva de los cerdos. Varias enzimas contribuyen a esta actividad esterasa:
- La colinesterasa (ChE) y la colesterol esterasa representan alrededor del 20% de la actividad TEA salival en cerdos sanos no estresados.
- La lipasa salival (sLip) podría rondar el 30% en cerdos sanos no estresados.
- La isoenzima 6 de la anhidrasa carbónica (CA-VI) podría representar hasta el 50% de la actividad de la TEA en la saliva porcina.
- TEA, BChE y sLip pueden medirse espectrofotométricamente, y existen ensayos validados para cerdos.
La TEA salival puede aumentar en situaciones de estrés agudo. Se ha descrito un aumento de la actividad de la TEA salival en cerdos, con un incremento de 1,49 veces justo después del estímulo, tras una sujeción mediante lazo nasal.
Además, se registró un aumento (1,8 veces) de la TEA salival a las 4 h del transporte y la estabulación en el matadero en comparación con los valores anteriores al transporte. Este aumento fue inferior al observado con otros biomarcadores como el cortisol.
El comportamiento de la TEA en saliva en estrés crónico debe ser evaluado más profundamente. En este sentido, podría verse aumentada en cerdos que sufren dolor debido a cojera y prolapso rectal.
Oxitocina (OT)
Esta hormona, además de su papel fisiológico en el parto y la lactancia, se considera un biomarcador de emociones positivas y bienestar social en animales domésticos.
El aumento de OT frente a situaciones positivas de bienestar contrasta con el resto de biomarcadores de estrés utilizados hasta ahora, que aumentan cuando existe una situación estresante o falta de bienestar.
La fuente de OT en la saliva es desconocida, pero un informe reciente en humanos indica que la OT salival puede reflejar la concentración y producción endógena.
En la saliva de los cerdos, al igual que en otras especies, la OT puede estar en dos formas principales:
- unida a proteínas o
- libre
Al igual que otros biomarcadores, el conocimiento sobre las mediciones de OT en la saliva de cerdos está en sus inicios.
La OT en la saliva puede disminuir en situaciones de estrés agudo. En un informe, se encontraron disminuciones en las concentraciones salivales de OT en cerdos a las 4 h de estabulación en un matadero. Esto podría indicar una reducción de los sentimientos positivos en esta situación, posiblemente debido a diversos estímulos estresantes como el proceso de descarga, la mezcla con cerdos desconocidos y los sonidos extraños. Dependiendo del ensayo utilizado, estas disminuciones fueron de diferente magnitud (42,2% frente a 27,5%), por lo que también el tipo de ensayo puede influir en la detección de cambios tras situaciones estresantes.
La OT puede aumentar por interacciones positivas. En un estudio en el que se evaluaron las interacciones positivas entre humanos y animales en cerdos, la concentración de OT en saliva se asoció positivamente con ser acariciado.
Además, la eyaculación aumenta las concentraciones salivales de OT en verracos reproductores. Por lo tanto, estos datos sugieren que esta hormona puede ser un marcador de emociones positivas.
Toma de muestras: recomendaciones generales
- Utilización de esponjas. Esto permite obtener saliva con menor contenido en mucina y por tanto menor viscosidad lo que facilita el procesado y manejo de las muestras.
- Si las muestras no se procesan inmediatamente, se recomienda refrigerarlas o al menos mantenerlas en un lugar fresco, hasta su llegada al laboratorio.
- Las muestras deben centrifugarse para eliminar los restos celulares y alimentarios. El protocolo de centrifugación que utilizamos en nuestro laboratorio es de 3.000×g durante 10 min a 4 °C.
- Lo ideal es conservar las muestras a – 20 °C o – 80 °C si no se van a analizar inmediatamente.
- La temperatura óptima de almacenamiento depende del analito. Por ejemplo, CgA y ADA son estables en saliva 1 año almacenados a – 20 °C; mientras que – 80 °C se recomienda para el almacenamiento prolongado de sAA o BChE y las enzimas y biomarcadores de estrés oxidativo en general. En general, a – 80 °C, los analitos son más estables que a – 20 °C.
CONCLUSIONES
La saliva de los cerdos puede utilizarse para medir biomarcadores que pueden ayudar a evaluar el estrés, la inflamación, el sistema inmunitario y la homeostasis redox.
Estos biomarcadores, reflejan que la saliva, además de ser una herramienta de diagnóstico para la detección de enfermedades infecciosas, puede proporcionar información potencialmente interesante sobre el estado de salud y bienestar del cerdo.
Sin embargo, todavía se necesitan más datos para validar el uso de la saliva en este campo. Por lo tanto, se espera que en un futuro próximo se generen más conocimientos sobre su fisiología y aplicaciones prácticas sobre los marcadores salivales aquí revisados, y también sobre otros nuevos que pudieran descubrirse, especialmente mediante técnicas “ómicas”.
Este conocimiento que se espera generar proporcionará información más precisa y útil sobre estos biomarcadores, contribuyendo a un uso más amplio de la saliva en esta especie, así como en otras especies animales y en humanos en el futuro.
Artículo traducido y adaptado de: Cerón, J.J. et al. (2022) “Basics for the potential use of saliva to evaluate stress, inflammation, immune system, and redox homeostasis in Pigs,” BMC Veterinary Research, 18(1). Available at: https://doi.org/10.1186/s12917-022-03176-w.1