Actinobacillus pleuropneumoniae es el agente causante de la pleuroneumonía porcina, una enfermedad con un impacto muy importante en la industria porcina.
Las manifestaciones más significativas se desarrollan durante el curso agudo de la enfermedad, que se caracteriza por una pleuroneumonía fibrinohemorrágica y necrotizante que, a menudo, va ligada a:
Las infecciones subclínicas en cambio, tienen un impacto en los índices productivos, pero a menudo solo son evidenciables como hallazgos de matadero.
IMPORTANCIA DEL SEROTIPADO DE APP
La identificación de los serotipos de A. pleuropneumoniae es crucial, ya que están directamente ligados a la respuesta inmunitaria adquirida del animal.
Actualmente, se reconocen 19 serotipos que se diferencian básicamente en la estructura antigénica de los polisacáridos capsulares (CPS) que vienen determinados por los genes involucrados en su biosíntesis (cps) organizados en operón.
Diferencias entre los serotipos 9 y 11
Los serotipos 9 y 11 fueron descritos en la década de 1980 y sus antígenos capsulares (CPS) tienen diferencias mínimas:
El serotipo 11 incorpora un radical B-D-Glc adicional a la cadena principal del propio CPS mientras que el serotipo 9 no lo hace (Figura 1).
Se han realizado estudios genéticos comparativos de las cepas de referencia de los serotipos 9 y 11 (Figura 2).
| Otros determinantes antigénicos, como el antígeno O (O-Ag) de los lipopolisacáridos (LPS) han sido también estudiados y definidos, presentando los serotipos 1, 9 y 11 cadenas O casi idénticas, lo que provoca reacciones serológicas cruzadas y limita la precisión diagnóstica. |
AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS SEROTIPOS 9 Y 11
Hasta la fecha, la única técnica laboratorial capaz de distinguir los serotipos 9 y 11 ha sido la inhibición de hemaglutinación (IHA).
Este método requiere enfrentar los aislamientos de A. pleuropneumoniae que se quieren caracterizar con antisueros específicos para cada serotipo, pero la limitada disponibilidad de antisueros comerciales de calidad y la dificultad en la interpretación de resultados hace que en la actualidad no sea una opción.
Las técnicas serológicas (i.e. ELISA), basadas en detección de anticuerpos frente al LPS en los animales infectados, y las técnicas moleculares (e.g. PCR o qPCR) que identifican una región de los genes cps de la bacteria, no han conseguido diferenciar estos serotipos de una forma consistente.
La introducción de nuevas técnicas moleculares aplicadas al diagnóstico, como la LNA-qPCR, ofrecen la posibilidad de diferenciar genes cuyas secuencias guardan alta homología de una forma directa, rápida y analizando múltiples muestras de forma simultánea.
Su aplicación en algunas situaciones puede suponer una alternativa eficaz a estudios de genoma completo (WGS), que ofrece un estudio detallado y más amplio, pero supone unos costes difícilmente asumibles para laboratorios clínicos que requieren resultados rápidos.
| El presente estudio buscó completar el diagnóstico de la pleuroneumonía porcina mediante el desarrollo de una LNA-qPCR capaz de identificar específicamente los serotipos 9 y 11 de A. pleuropneumoniae. |
Material y métodos 
Durante el estudio se evaluaron dos colecciones de aislamientos diferentes:
Se diseñaron dos ensayos LNA-qPCR basados en sonda de hidrólisis LNA, dirigida al gen diana cpsF, que podían identificar de forma específica si un aislamiento pertenecía al serotipo 9 o al 11, mediante la identificación de la mutación en la posición 95 de dicho gen.
Asimismo, se realizó la secuenciación del gen completo cpsF de los 12 aislamientos procedentes de Hungría mediante secuenciación por nanoporos (ONT) a través del dispositivo minION.
Resultados y discusión 
LNA-qPCR VS CEPAS DE REFERENCIA
Los ensayos LNA-qPCR diferenciaron de manera efectiva las cepas de referencia de los serotipos 9 y 11.
Su especificidad y sensibilidad fue valorada a través de la colección de cepas de referencia.
LNA-qPCR VS CEPAS DE CAMPO
Todos los aislamientos provenientes de brotes clínicos resultaron positivos a serotipo 11 mediante los ensayos LNA-qPCR, incluidos aquellos de Hungría que previamente habían sido identificados como serotipo 9 por IHA.
Las discrepancias entre los resultados obtenidos mediante la LNA-qPCR y los previamente obtenidos por IHA en las cepas de Hungría, fueron resueltas mediante la secuenciación ONT completa del gen cspF.
Esta técnica permitió identificar 3 nuevas mutaciones a lo largo del gen estudiado presentes en las 7 cepas identificadas como serotipo 9 por IHA. Estos diferentes eventos, todos ellos diferentes al encontrado en la cepa de referencia del serotipo 9, consistían en:
| Todas ellas alteran el marco de lectura (ORF) del gen cpsF y, por tanto, codifican una enzima con una función alterada. |
Por otra parte, los 5 aislamientos previamente identificados como serotipo 11 por IHA presentaban un gen cpsF intacto, siendo su secuencia idéntica a la de la cepa de referencia del serotipo 11.
El presente estudio puso de manifiesto que diferentes eventos genéticos pueden generar estructuras CPS propias del serotipo 9. Por ello, un ensayo LNA-qPCR, aunque tenga gran capacidad de discriminación genética, no puede diseñarse para que detecte todas las mutaciones que pueden hacer que un aislamiento se diferencie hacia serotipo 9 en vez de serotipo 11.
Debido al limitado número de aislamientos (n=12) donde se ha podido obtener información completa del gen cpsF no se puede asegurar que no existan otros eventos de mutación diferentes a los descritos que determinen que un aislamiento se identifique como serotipo 9 y no como serotipo 11.
No obstante, la información generada se alinea con los estudios que otorgan al antígeno CPS un papel fundamental en la determinación del serotipo.
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CONCLUSIÓN
| Los serotipos 9 y 11 de A. pleuropneumoniae presentan una gran similitud a nivel antigénico y genético. Sin embargo, sutiles diferencias en su CPS son relevantes para la determinación de un serotipo u otro.
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