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Aproximación diagnostica y alternativas para monitorizar el PRRSV

Escrito por: Pablo Pineyro - Dpto. de Diagnóstico Veterinario y Medicina de Animales de Producción, Facultad de Veterinaria de la Universidad Estatal de Iowa, EE.UU

El virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV) es y ha sido el agente causal de enormes pérdidas económicas para la industria porcina alrededor del mundo.  El virus emergió en los Estados Unidos a finales de la década de los 80 y, simultáneamente, se reportaron presentaciones clínicas similares en Alemania y otros países de Europa.

Sorprendentemente, se observó que, a pesar de la variabilidad genética observada entre las cepas descritas en Europa y en Estados Unidos, estos dos virus tenían manifestaciones clínicas similares.

Estos primeros estudios demostraron que las cepas europea y americana solo compartían un 50 -70% de homología en su estructura genética. Así, se definieron dos genogrupos distintos:

Genotipo 1: cepas europeas

Genotipo 2: cepas americanas

 

 

 

PRRSV – BACK TO BASICS

El PRRSV es un virus ARN perteneciente a la familia Arterivirus (orden Nidovirales) que presenta:

 Manifestaciones clínicas del PRRS  

Las manifestaciones clínicas del PRRS pueden variar desde formas leves asintomáticas, a enfermedad severa asociada a altos porcentajes de mortalidad debido a infecciones secundarias, susceptibilidad del hospedador, inmunidad del grupo y virulencia de la cepa implicada.

  CERDAS ADULTAS  

Los animales adultos afectados presentan anorexia y fiebre seguido de FALLOS REPRODUCTIVOS:

Abortos
Incremento en el número de lechones momificados
Retorno al estro

En cuadros asociados a fallos reproductivos, los abortos son el resultado de infección sistémica en la cerda, observándose[registrados] principalmente durante el primer tercio de la gestación.

La infección en las cerdas induce liberación masiva de interferón gamma y otras interleucinas proinflamatorias, resultando en fallo reproductivo.

Durante el segundo y último tercio de la gestación, los fallos reproductivos se deben a daño específico de macrófagos placentarios sobre la barrera materno-fetal.

  LECHONES  

Los lechones recién destetados pueden sufrir CUADROS RESPIRATORIOS severos que se pueden ver agravados por coinfecciones con otros virus (Influenza, Circovirus) o por infecciones bacterianas secundarias, lo que se traduce en:

Incremento en la tasa de mortalidad en las etapas de transición y engorde.

  Retraso en el crecimiento en animales que se recuperan de la infección, prolongando el tiempo necesario para alcanzar el peso de sacrificio.

 

 

 

 

 

Patogenia y cuadro lesional asociado al PRRSV

La patogenia del PRRSV está asociada a la multiplicación del virus en macrófagos alveolares, intravasculares, células dendríticas y monocitos activados.

La infección ocasiona la necrosis de estas células inmunitarias, produciéndose un incremento de interleucinas inflamatorias a nivel sistémico y, como resultado, una respuesta inflamatoria severa a nivel pulmonar.

Como consecuencia de la necrosis severa de macrófagos, se reducen significativamente los mecanismos de defensa pulmonar, predisponiendo al hospedador a infecciones bacterianas secundarias.

En estos casos, se pueden observar áreas con grandes agregados de neutrófilos característicos de neumonía supurativa.

Desde el punto de vista anatomopatológico, es habitual observar neumonía intersticial leve a neumonía intersticial complicada con áreas de bronconeumonía sobreagregadas debido a infecciones bacterianas secundarias.

A nivel de linfonodos, se puede observar:

Hiperplasia linfoide

Necrosis o apoptosis de linfocitos

Las alteraciones a nivel pulmonar se manifiestan clínicamente como afectación respiratoria severa, disnea y cianosis.

 

APROXIMACIÓN DIAGNÓSTICA AL PRRS

El diagnóstico del PRRSV puede tener distintos objetivos que tendrán un impacto directo en decisiones de manejo en la granja, siendo importante definir los objetivos de los programas diagnósticos, por ejemplo:

Determinación del agente causal de un brote de abortos/cuadros respiratorios.

Determinación de la prevalencia del PRRSV en la población.

Confirmación de la exposición/ eliminación del PRRSV.

Determinación de la dinámica de circulación viral.

Confirmación de la eficacia de protocolos de vacunación.

Detección del PRRSV mediante PCR

Para el diagnóstico directo, el método más utilizado en la actualidad es la detección del ARN viral mediante PCR.

Los laboratorios utilizan distintas regiones del virus como targets para sus diagnósticos, incluyendo cebadores específicos para la proteína estructural de matriz (ORF6), para la nucleoproteína (ORF7) y para alguna de las proteínas no estructurales (nsp2).

Debido a la gran variabilidad genética observada en la región ORF5, las PCR dirigidas contra proteínas estructurales son las preferidas para la secuenciación, lo que permite evaluar esta variabilidad genética dentro de la granja o a nivel regional.

Las muestras requeridas para el diagnóstico directo por PCR pueden incluir:

Secciones de pulmón que presenten lesiones características
Tonsilas y linfonodos
Timo
Lavado broncoalveolar
Semen
Sangre y suero

En casos reproductivos, las muestras de tejidos obtenidos a partir de fetos abortados son muy importantes para confirmar la implicación del PRRVS como agente causal de abortos o fallos reproductivos.

Cabe recordar que el virus también puede ocasionar un incremento significativo en el número de lechones momificados, lo que debe tenerse en cuenta al realizar el diagnóstico diferencial con otros virus asociados a procesos reproductivos, como Parvovirus.

Hoy en día, los fluidos orales se utilizan con mayor frecuencia para los estudios epidemiológicos y la monitorización en las granjas debido a su practicidad y bajo coste.

Otro de los avances de cara a la detección del PRRSV es la evaluación de fluidos de procesado de camada, incluyendo fluidos extraídos de los testículos y colas en el momento del procesado de los lechones en maternidad.

Estas últimas muestras permiten evaluar la presencia del virus en granjas de madres y determinar si los lechones se infectan a edad temprana.

Uno de los métodos más utilizados para reducir costes es el agrupamiento de muestras, ya sea de sueros, fluidos orales, semen y/o tejidos.

La desventaja de esta práctica es la pérdida de sensibilidad en el momento de la detección viral, especialmente, en granjas con baja prevalencia o muestras con baja carga viral.

La técnica de PCR es rápida y tiene gran sensibilidad y especificidad. Sin embargo, debido a su alta sensibilidad, la contaminación ambiental en granjas endémicas donde el virus está presente en el ambiente es relativamente fácil.

Debemos recordar que la interpretación de los resultados se debe hacer en concordancia con los signos clínicos observados en la granja. La detección de animales positivos por PCR puede significar que hay:

Cerdos virémicos (infección natural).

Cerdos vacunados con virus vivo modificado o con virus inactivado.

Contaminación ambiental de la muestra (falso positivo).

Determinación de la variabilidad genética del PRRSV

  CARACTERIZACIÓN MEDIANTE RFLP  

Más allá de la detección viral, también se debe tener información precisa de la caracterización genética del virus para garantizar el movimiento seguro de los animales entre establecimientos, evitando así la diseminación de nuevas variantes a establecimientos negativos o previamente infectados con cepas heterólogas.

La técnica de digestión con enzimas de restricción (RFLP) de la región ORF5 utiliza 3 enzimas de restricción (Mlul, HincII, y SacII) que cortan la secuencia nucleotídica en regiones específicas, dando así patrones específicos codificados numéricamente para cada enzima.

Esta tecnología fue originalmente diseñada para diferenciar cepas vacunales de cepas de campo. Sin embargo, debido a la gran variabilidad genética, a los cambios constantes durante la replicación in vivo y a la reversión observada en cepas vacunales, esta tecnología se considera cada vez menos sensible para establecer la relación genética entre los virus detectados.

Es sabido que el cambio en un solo nucleótido puede cambiar el patrón RFLP, sin observarse cambios en la patogenicidad, tasa de replicación o significancia clínica.

  SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO  

Hoy en día, la variabilidad genética se evalúa a través de la secuenciación y análisis filogenético debido a que estas técnicas son mucho más fiables y generan información exacta sobre la composición genética de las cepas evaluadas.

La secuenciación se realiza generalmente en el segmento ORF5, pero también se puede incluir el segmento ORF6:

El segmento ORF5 se considera el segmento más variable, mientras que el segmento ORF6 es el más conservado.

La evaluación del segmento ORF5 permite monitorizar la evolución genética del PRRSV en un establecimiento a lo largo del tiempo.

Los laboratorios de diagnóstico generalmente presentan los resultados de secuenciación de ORF5 en relación porcentual con respecto a las cepas de referencia de los virus vacunales.

Aislamiento del PRRSV

Otro método utilizado para el diagnóstico del PRRS es el aislamiento viral, técnica basada en la capacidad del virus de generar un efecto citopático en un gran número de líneas celulares (MARC-145, BHK21 y CL-262).

Dependiendo de la cepa viral y su virulencia, el efecto citopático puede no ser tan marcado.

En estos casos, la confirmación de la infección se debe realizar por marcación con anticuerpos fluorescentes o detección de partículas virales por microscopía electrónica.

Tal vez una de las desventajas de este método es el tiempo necesario para la confirmación (5-8 días). Además, la interpretación de los resultados debe ser cuidadosa, ya que resultados de aislamiento viral negativo pueden significar que los animales no han sido infectados o que las partículas presentes no son infectivas debido a:

El bloqueo por anticuerpos neutralizantes.
La degradación del virus en las muestras.
La baja sensibilidad de las células utilizadas para el aislamiento.

Detección del PRRSV en tejidos

La detección in situ es muy relevante, ya que permite asociar la presencia del PRRSV al cuadro lesional. Así, la evaluación de tejidos fijados para histopatología se puede complementar con:

La detección de antígenos de PRRSV mediante inmunohistoquímica (IHQ)

La detección de ácido nucleico de PRRSV mediante hibridación in situ (HIS)

Para ambas técnicas se utilizan tejidos fijados en formol al 10% incluyendo:

Pulmón
Tonsilas y linfonodos
Corazón, cerebro y bazo

La IHQ tiene gran especificidad y moderada sensibilidad, permitiendo detectar con al menos un 90% de certeza animales infectados con el PRRSV.

Recordemos que las lesiones asociadas al PRRSV pueden ser de carácter multifocal, por lo que se deben tomar muestras representativas de pulmón, incluyendo al menos 5 secciones por animal evaluado.

Para el diagnóstico de tejidos debemos tener en cuenta el momento de infección:

El antígeno viral puede ser detectado fácilmente dentro de las primeras 4 semanas post-infección.

Su detección se vuelve más limitada entre los 30 y 70 días, e indetectable más allá de los 90 días post-infección.

A la hora de interpretar los resultados, es importante tener en cuenta qué resultados negativos se deben a la ausencia del virus y cuáles se pueden atribuir a errores de muestreo, fallos de la técnica o del operador observando la tinción en tejidos, así como a la variabilidad genética de la cepa evaluada, ya que podría no ser detectada por los anticuerpos de rutina.

 

CONTROL DEL PRRSV

Una de las características más importantes y que dificulta el control y erradicación del PRRSV es su rápida capacidad de mutación y evolución. Hoy en día, el manejo de la enfermedad está basado en:

 1.  La vacunación

 2.  La implementación de medidas de bioseguridad para prevenir la diseminación o introducción del virus a la granja

Numerosas vacunas comerciales se encuentran disponibles incluyendo:

Vacunas basadas en virus vivo modificado

Vacunas basadas en virus muerto

Vacunas de subunidades proteicas

Los programas de aclimatación de reproductoras basados en la exposición intencional a la cepa circulante en la granja es una de las rutinas que se puede utilizar para inducir inmunidad de grupo en el hato reproductor.

El diagnóstico y monitorización del PRRSV es complicado debido a la naturaleza del virus, la dinámica y flujo de los animales, los avances en las distintas técnicas diagnósticas y las técnicas para prevenir la manifestación clínica de la enfermedad.

No obstante, los sistemas de monitorización y diagnóstico de la enfermedad son esenciales para los programas de control y erradicación, siendo necesario confirmar los resultados de laboratorio evaluándolos teniendo en cuenta el contexto clínico.

Las nuevas técnicas moleculares permiten hacer estudios epidemiológicos más fiables, mientras que la detección de antígenos permite realizar un mejor diagnóstico de los casos clínicos. Por otro lado, las pruebas serológicas ayudan a determinar la exposición previa.

Es fundamental entender y tener siempre presente el objetivo del proceso diagnóstico y monitorización para poder aplicar la mejor rutina de muestreo y utilizar la técnica más apropiada para cumplir con el objetivo propuesto.

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