|
La ingestión de carne contaminada con residuos de antibióticos puede generar toxicidad directa, reacciones alérgicas y/o disbiosis de la microbiota intestinal, además de contribuir al desarrollo de resistencias a antibióticos, fenómeno que que se considera ya como uno de los diez mayores retos a los que se enfrenta la humanidad en las próximas décadas. |
IMPORTANCIA DE LA MONITORIZACIÓN DE RESIDUOS DE ANTIMICROBIANOS EN CARNE
Los antibióticos son herramientas indispensables para salvaguardar la salud humana y animal en el marco One Health. Sin embargo, a pesar de que los últimos datos publicados muestran que en Europa hay un mayor consumo en medicina humana que veterinaria (EFSA, 2021a), su uso está todavía extendido en animales de producción, incluso con fines no terapéuticos (Brown et al., 2017; Diana et al., 2020), generando graves problemas para la salud pública.
La ingestión de carne contaminada con residuos de antibióticos puede generar toxicidad directa, reacciones alérgicas y/o disbiosis de la microbiota intestinal, y dar lugar al incremento de resistencias a antibióticos (AMR) que se pueden acumular en nuestra microbiota intestinal (Wang et al., 2016), fenómeno acrecentado por la liberación al medio ambiente de los residuos antimicrobianos utilizados en las granjas (Hamscher et al., 2005; Sarmah et al., 2006; Zhou et al., 2020), tanto que la OMS (Organización Mundial de la Salud) ya lo considera como uno de los 10 mayores retos a los que se enfrenta la humanidad en las próximas décadas (OMS, 2021).
Un buen control de los tratamientos antimicrobianos en granja es suficiente para evitar su aparición en la carne, lo que, unido al buen hacer de veterinarios y ganaderos, estrategias como las propuestas por la Agencia Europea del Medicamento (EMA, 2020) y una legislación conservadora, han conseguido rebajar la notificación de muestras no-conformes hasta un 0,14% en 2019 en Europa (Agencia Europea de Seguridad Alimentaria EFSA, 2021b). Sin embargo, no existen datos sobre las muestras que contienen residuos de antibióticos por debajo de los LMR (Límites Máximos de Residuos, Reg. 37/2010).
|
Puesto que España y Francia son los países con la producción cárnica más alta de Europa (Eurostat, 2020), y están entre los mayores consumidores europeos (Kanerva, 2013) e incluso a nivel mundial (FAO, 2021), se planteó un estudio para evaluar la incidencia de residuos antimicrobianos en carne comercializada del área transfronteriza España-Francia (POCTEFA), procedente de cinco de las ciudades más pobladas y diferentes especies animales, y tipificar las tendencias de su aparición mediante un análisis secuencial (mediante método de cribado y confirmatorio, Reg. 2017/625) análogo al propuesto en control oficial. |
MATERIALES Y MÉTODOS
RECOGIDA DE MUESTRAS COMERCIALES
Se recogieron 5.357 muestras de carne comercial de cinco ciudades: Zaragoza, Logroño, Bilbao, Perpiñán y Toulouse. El número de muestras por especie y ciudad se recoge en la Tabla 1.[registrados]
Todas las muestras se analizaron de acuerdo a la normativa vigente (Reglamento 2021/808).
El test Explorer® es un test de base biológica para el cribado de un amplio espectro de antibióticos, mientras que QuinoScan® detecta específicamente quinolonas, familia para la cual no es sensible Explorer®. El programa GraphPad Prism® (San Diego, California, USA) se utilizó para la representación de resultados y los análisis estadísticos por ANOVA.
RESULTADOS
| Resultados del cribado de amplio espectro de antibióticos
La Tabla 2 muestra los resultados del cribado de amplio espectro de antibióticos de las 5.357 muestras de carne comercial, clasificados por especies y ciudades. Globalmente, el 3,5% de las muestras recogidas resultaron positivas.
Especies con un tamaño muestral pequeño (n ≤ 50) no se consideraron representativas. |
ANÁLISIS DE CRIBADO
| Resultados del cribado de quinolonas
Los resultados del cribado de quinolonas se muestran en la Tabla 3, clasificados por especies y ciudades. En total, el 0,2% de las muestras resultaron positivas a la presencia de quinolonas. |
| Resultados generales del cribado
Los resultados finales del cribado están representados en la Tabla 4, organizados por especies y ciudades, y son resultado de sumar los resultados del cribado de amplio espectro de antibióticos y los del cribado de quinolonas. |
EN TOTAL, 194 MUESTRAS FUERON POSITIVAS AL CRIBADO, LO QUE CORRESPONDE A UN 3,6% DE LAS MUESTRAS RECOGIDAS
ANÁLISIS CROMATOGRÁFICOS DE CONFIRMACIÓN
Tras el cribado, las 194 muestras positivas se analizaron por UHPLC-QTOF (de aquí en adelante, QTOF).
Se confirmó que 30 de ellas (15,2%) contenían residuos (Tabla 5), con la siguiente distribución:
- Tetraciclinas (40,6%)
- Sulfamidas (37,5%)
- Quinolonas (18,8%)
- Lincomicina (3,1%)
Solamente el 0,093% del total de las muestras recogidas fue no conforme (contenían residuos de antibióticos por encima de los niveles que marca el Reg. 37/2010).
De las 194 muestras positivas, 5 tuvieron concentraciones próximas a los LMR (56-96 µg/kg) y otras 20 presentaron concentraciones muy bajas. En cambio, en las 164 muestras restantes, no se identificaron residuos de antibióticos.
No obstante, existe un amplio gap entre el 3,6% de positivos al cribado y el ~0,1% de positivos a la cromatografía.
ESTUDIOS ADICIONALES PARA DETECTAR LAS CAUSAS DE LA DIVERGENCIA ENTRE LOS RESULTADOS DEL CRIBADO Y LA CONFIRMACIÓN CROMATOGRÁFICA
|
El test de amplio espectro para el cribado de antibióticos, basado en la inhibición del crecimiento de microorganismos sensibles, detectó el mayor porcentaje de positivos del cribado, lo que demuestra la presencia de metabolitos biológicamente activos. |
Por su parte, la cromatografía detecta las moléculas diana en una muestra en base a su composición química. |
Por ello, se plantearon diversas hipótesis que pudieran explicar la presencia de moléculas inhibitorias del crecimiento bacteriano en el cribado de amplio espectro de antibióticos pero que no son detectables por la cromatografía dirigida.
ANTIMICROBIANOS ALTERNATIVOS: ACEITES ESENCIALES
En un esfuerzo por reducir la administración de antibióticos en ganadería, el uso de sustancias naturales con actividad antibiótica está aumentando. Entre éstas destacan los aceites esenciales, ya que mejoran la salud general de los animales, el rendimiento e incluso la calidad de la carne (Omonijo et al., 2018).
La bioacumulación a nivel muscular de los aceites esenciales añadidos a los piensos podría ser responsable de su inhibición y, por tanto, de las altas tasas de muestras positivas al cribado de amplio espectro de antibióticos que no se confirmaron por QTOF.
Para evaluar lo acertado de esta hipótesis, muestras de carne blanca se doparon con concentraciones conocidas de aceites esenciales y, a pesar de que el carvacrol, orégano y cinamaldehído inhibieron el crecimiento de G. stearothermophilus, dando resultados positivos al cribado de amplio espectro de antibióticos, tal y como se muestra en la Tabla 6, las concentraciones fueron superiores a 200 µL/L, lo que aportaría un olor y sabor tan intenso que resultaría desagradable. Por ello, se descartaron como responsables de la elevada positividad del cribado vs QTOF.
PRESENCIA DE METABOLITOS BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS PROCEDENTES DE LA DEGRADACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS ORIGINALMENTE PRESENTES EN MÚSCULO
1. Análisis confirmatorios de residuos antibióticos en muestras aleatorias negativas al cribado
De entre las muestras de carne comercial negativas al test de cribado, se tomaron 138 de forma aleatoria y se analizaron por QTOF para comprobar la presencia de trazas de antibióticos entre las muestras negativas y corroborar el buen funcionamiento de los tests, ya validados.
LA FAMILIA MÁS DETECTADA FUERON LAS TETRACICLINAS (63,2% DE LAS MUESTRAS CON RESIDUOS), SEGUIDA POR LAS QUINOLONAS (15,8%), LINCOMICINA (10,5%) Y SULFAMIDAS Y ß-LACTÁMICOS (5.3% PARA CADA UNA DE ELLAS)
La diferencia entre el porcentaje de muestras positivas al cribado que contenía residuos de antibióticos identificados por QTOF (15,5%) y el porcentaje de muestras negativas al cribado que contenían estos residuos analizados por el mismo método (12,3%), fue del 3,2%.
Las muestras adicionales positivas al cribado y con trazas de antibióticos podrían contener metabolitos biológicamente activos derivados del compuesto original. Así, tanto los antibióticos originales como sus metabolitos, que pasarían inadvertidos para la cromatografía dirigida, serían responsables de la inhibición observada en el cribado.
No obstante, aunque estos resultados apoyan la hipótesis de la presencia de metabolitos biológicamente activos, fue necesario llevar a cabo experimentos adicionales para demostrar su presencia.
2. Presencia en carne de metabolitos biológicamente activos derivados de los antibióticos originales
En el caso de que estos metabolitos existiesen en las muestras de carne, éstos deberían proceder de la degradación de los compuestos originales. Como su estructura química sería diferente a la del compuesto original, pasarían inadvertidos para las técnicas cromatográficas empleadas en control oficial, dirigidas a la detección
de compuestos marcador definidos por la legislación (Reg. 37/2010 para sustancias autorizadas y 2019/1871 para las no autorizadas).
Para comprobar esta hipótesis, se estudiaron muestras de carne congeladas procedentes del banco de muestras construido por Serrano et al. (2020), con concentraciones conocidas de antibióticos (deteminadas por QTOF en 2018), envasadas al vacío y mantenidas en congelación a -20°C desde entonces hasta su re-análisis mediante el test de cribado y análisis cromatográfico QTOF en 2021.
Los análisis cromatográficos detectaron degradación de los antibióticos (P ≤ 0.05) diferente en función del compuesto (Figura 1).
- La oxitetraciclina no mostró degradación.
- La amoxicilina se degradó de forma completa.
- La enrofloxacina (26-55% de degradación) y la sulfametoxi-piridazina (5-39%) mostraron un comportamiento intermedio.
La degradación de antibióticos tras el almacenamiento en congelación ya ha sido descrita previamente (Shaltout et al., 2019).
Para confirmarlo, se llevaron a cabo los experimentos que se detallan a continuación.
|
Presencia de metabolitos de ß-lactámicos biológicamente activos en muestras de carne naturalmente contaminadas con amoxicilina (detección basada en reconocimiento bioquímico estructural). BTScan® (Zeulab, Zaragoza, España) es un test actualmente comercializado, basado en inmunocromatografía de flujo lateral que detecta la presencia de ß-lactámicos y tetraciclinas. Para evaluar la presencia potencial de metabolitos activos de ß-lactámicos en muestras de carne, se tomaron 4 muestras de carne procedentes del banco de muestras (Serrano et al., 2020), caracterizadas por cromatografía LC-MS/MS en 2018, y se re-analizaron en 2021. La Tabla 8 muestra que, a pesar de que el antibiótico se degradaba por completo tras 3 años de almacenamiento, las muestras seguían siendo capaces de inhibir el crecimiento del microorganismo diana del test de cribado, no solo en 2018, cuando se detectaban elevadas concentra-ciones, sino también en 2021.
Así, existen metabolitos biológicamente activos de amoxicilina en muestras de músculo procedentes de su degradación durante el almacenamiento en congelación que podrían ser responsables de resultados positivos en tests de cribado de base biológica, pudiendo pasar desapercibidos para técnicas cromatográficas empleadas rutinariamente en control oficial. |
Detección de metabolitos de sulfamidas basada en inhibición competitiva de su actividad biológica Las sulfamidas son compuestos antimicrobianos con actividad bacteriostática relacionada con la inhibición de la síntesis del ADN, compitiendo con el ácido parami-nobenzóico (pABA), necesario para la síntesis de ácido fólico en bacterias. Para comprobar la presencia de sulfamidas, se tomaron 8 muestras de carne procedentes del banco de muestras (Serrano et al., 2020), contaminadas con sulfamidas a concentraciones inferiores al LMR, y se analizaron mediante el cribado de amplio espectro de antibióticos antes y después de la adición de 50 µg/mL de pABA (FIL/IDF, 1991; Sanz et al., 2015). La Figura 2A ilustra la positividad de las muestras antes de la adición de pABA (valores del cribado acoplado a e-Reader® por encima del cut-off o valor del método por encima del cual una muestra se considera positiva) y cómo el efecto inhibitorio desapareció tras la adición de pABA (P ≤ 0.05), lo que demuestra la competencia de este compuesto con metabolitos biológicamente activos presentes en la carne, presumiblemente procedentes de la degradación de la sulfamida original con la que se trató a los animales y que no se detectaron por la técnica cromatográfica dirigida. Además, se re-analizaron 18 muestras de carne comercial recogidas en el presente estudio, positivas al cribado, pero negativas a los análisis cromatográficos por QTOF, de las cuales solo 3 seguían manteniendo positividad tras 8 meses en congelación (S12-S14, Figura 2B).
La fiabilidad del pABA se comprobó con la muestra S15, una muestra de carne comercial que, caracterizada por QTOF, contenía 82 µg/kg de sulfadiazina en el momento de su recogida, y positiva al cribado incluso tras 8 meses de almacenamiento en congelación, ya que, tal y como muestra la la Figura 2, hubo pérdida de la capacidad inhibitoria de la sulfamida tras la adición de pABA. |
|
Estos hallazgos demostraron la presencia en carne de metabolitos biológicamente activos procedentes de los antibióticos originales. Así pues, los análisis cromatográficos ofrecen la ventaja de la caracterización de las muestras (identificación + cuantificación del antibiótico), pero su análisis no detecta la presencia de estos metabolitos debido a su carácter dirigido. Es por esto que los test biológicos de cribado ofrecen ciertos beneficios, puesto que permiten detectar de manera directa la actividad biológica de los antibióticos y sus metabolitos. |
CONCLUSIONES
El análisis secuencial (cribado + confirmación) de 5.357 muestras de carne comercializada del área transfronteriza España-Francia mostró un 3,6% de muestras positivas al cribado mientras que los análisis cromatográficos dirigidos (QTOF) mostraron no conformidad en el 0,093%, datos similares a los publicados por la EFSA para 2019.
LAS FAMILIAS MÁS DETECTADAS FUERON TETRACICLINAS, SULFAMIDAS, QUINOLONAS, LINCOMICINA Y ß-LACTÁMICOS
Pruebas adicionales demostraron la presencia de metabolitos biológicamente activos procedentes de la degradación del antibiótico original detectados por el test biológico de cribado de amplio espectro de antibióticos, pero no por la cromatografía dirigida empleada en este estudio y en los controles oficiales.
Agradecimientos
El proyecto ha sido cofinanciado al 65% por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a través del Interreg V-A España, Francia, Andorra (POCTEFA 2014-2020). El objetivo de POCTEFA es reforzar la integración económica y social de la zona fronteriza España-FranciaAndorra. Su ayuda se concentra en el desarrollo de actividades económicas, sociales y medioambientales transfronte-rizas a través de estrategias conjuntas a favor del desarrollo territorial sostenible.
Te puede interesar: Detección de residuos de antibióticos en animales de producción previo al sacrificio
BIBLIOGRAFÍA
Agreste, 2020. Ministere de l´Agriculture et de l´Alimentation. Agreste, la statistique, l´évaluation et la prospective agricole. Synthesis conjuncturelles. La consummation de viande en France en 2019. June 2020. Recuperado de: https://www.franceagrimer.fr/fam/content/download/64687/document/NCO-VIA-Consommation%20de%20viandes%20en%20France-2019.pdf?version=1. Consultado: 14 de julio de 2020.
Brown, K., Uwiera, R. R., Kalmokoff, M. L., Brooks, S. P. & Inglis, G. D. (2007). Antimicrobial growth promoter use in livestock: a requirement to understand their modes of action to develop effective alternatives. International Journal of Antimicrobial Agents, 49(1), 12-24.
De Haro, 2015. Efecto de los Aceites Esenciales de Plantas Aromático-Medicinales en la Fase de Transición de Animales Monogástricos. Tesis doctoral. Universidad de Murcia. Recuperado de: https://digitum.um.es/digitum/bitstream/10201/43769/1/Tesis_MDHG.pdf.Consultado: 22 de mayo de 2021.
Diana, A., Santinello, M., Penasa, M., Scali, F., Magni, E., Alborali, G. L., Bertocchi, L.; De Marchi, M. (2020). Use of antimicrobials in beef cattle: an observational study in the north of Italy. Preventive Veterinary Medicine, 81, 105032.
EFSA, 2017. ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), EFSA (European Food Safety Authority) and EMA (European Medicines Agency). ECDC/EFSA/EMA Second Joint Report on the Integrated Analysis of the Consumption of Antimicrobial Agents and Occurrence of Antimicrobial Resistance in Bacteria from Humans and Food-Producing Animals. Joint Interagency Antimicrobial Consumption and Resistance. Analysis (JIACRA) Report. EFSA Journal, 15, e04872. Recuperado de: https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/efs2_4872_final.pdf. Consultado: 10 de noviembre de 2020.
EFSA, 2021a. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC), European Food Safety Authority (EFSA), & European Medicines Agency (EMA). (2021). Third joint inter‐agency report on integrated analysis of consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from humans and food‐producing animals in the EU/EEA: JIACRA III 2016‐2018. EFSA Journal, 19(6), e06712.
EFSA, 2021b. Report for 2019 on the results from the monitoring of veterinary medicinal product residues and other substances in live animals and animal products. (2021) Recuperado de: https://efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.2903/sp.efsa.2021.EN-1997 Consultado:12 de septiembre de 2021.
EMA, 2020. Categorisation of antibiotics for use in animals for prudent and responsible use. Recuperado de: https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/infographic-categorisation-antibiotics-useanimals-prudent-responsible-use_en.pdf Consultado el 27 de abril de 2021.
EMA, 2021. Sales of veterinary antimicrobial agents in 31 European countries in 2019 and 2020. Recuperado de: https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/sales-veterinary-antimicrobial-agents-31-european-countries-2019-2020-trends-2010-2020-eleventh_en.pdf Consultado: 14 de julio de 2021.
Eurostat, 2020. Estatistics Explained. Agricultural production – livestock and meat. Recuperado de: https://ec.europa.eu/eurostat/statistics-explained/index.php?title=Agricultural_production_-_livestock_and_meat&oldid=427096#Meat_production. Consultado: 28 de octubre de 2021,
FAO, 2021. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Food Supply – Livestock and Fish Primary Equivalent. Recuperado de: https://www.fao.org/faostat/en/#data/CL. Consultado: 29: de junio de 2021.
FIL/IDF International Dairy Federation. (1991). Detection and confirmation of inhibitors in milk and milk products. IDF Bulletin 258. Bruselas, Bélgica. pp 99.
Hamscher, G., Pawelzick, H. T., Höper, H. & Nau, H. (2005). Different behavior of tetracyclines and sulfonamides in sandy soils after repeated fertilization with liquid manure. Environmental Toxicology and Chemistry, 24(4), 861-868.
Kanerva, M. (2013). Meat consumption in Europe: Issues, trends and debates. Recuperado de: https://www.ssoar.info/ssoar/bitstream/handle/document/58710/ssoar-2013-kanerva-Meat_consumption_in_Europe_issues.pdf?sequence=3. Consultado: 15 de septiembre de 2020.
MAPA, 2019. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Informe del consume de alimentación en España 2019. Recuperado de: https://www.mapa.gob.es/en/alimentacion/temas/consumo-tendencias/informe2019_v2_tcm38-540250.pdf. Consultado: 10 de octubre de 2021.
Mata, L.; Sanz, D.; Razquin, P. Validation of the Explorer® 2.0 test coupled to e-Reader® for the screening of antimicrobials in muscle from different animal species. Food Addit. Contam.: Part A 2014, 31, 1496-1505.
Omonijo, F. A., Ni, L., Gong, J., Wang, Q., Lahaye, L., & Yang, C. (2018). Essential oils as alternatives to antibiotics in swine production. Animal Nutrition, 4(2), 126-136.
OMS, 2021. World Health Organization. Antimicrobial resistance. Recuperado de: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance Consultado: 20 de noviembre de 2021.
Sanz, D.; Razquin, P.; Condón, S.; Juan, T.; Herráiz, B.; Mata, L. Incidence of antimicrobial residues in meat using a broad spectrum screening strategy. European Journal of. Nutrition and Food Safety. 2015, 5, 156-165.
Sarmah, A. K., Meyer, M. T., & Boxall, A. B. (2006). A global perspective on the use, sales, exposure pathways, occurrence, fate and effects of veterinary antibiotics (VAs) in the environment. Chemosphere, 65(5), 725-759.
Serrano, M. J., Elorduy, J., Zabaleta, I., Istamboulie, G., González-Fandos, E., Bousquet-Mélou, A., … & Pagán, R. (2022). Antimicrobial residue assessment in 5,357 commercialized meat samples from the Spain-France cross-border area: A new approach for effective monitoring. Food Control, 138, 109033.
Serrano, M. J., Mitjana, O., Bonastre, C., Laborda, A., Falceto, M. V., García-Gonzalo, D., … & Pagán, R. (2020). Is blood a good indicator for detecting antimicrobials in meat? Evidence for the development of in vivo surveillance methods. Antibiotics, 9(4), 175.
Shaltout, F. A. E., Shatter, M. A. E., & Sayed, N. F. (2019). Impacts of different types of cooking and freezing on antibiotic residues in chicken meat. Journal of Food Science and Nutrition, 5, 045.
Voundi, S. O., Nyegue, M., Lazar, I., Raducanu, D., Ndoye, F. F., Stamate, M., & Etoa, F. X. (2015). Effect of essential oils on germination and growth of some pathogenic and spoilage sporeforming bacteria. Foodborne pathogens and disease, 12(6), 551-559.
Wang, S., Zeng, X., Yang, Q., & Qiao, S. (2016). Antimicrobial peptides as potential alternatives to antibiotics in food animal industry. International journal of molecular sciences, 17(5), 603.
Zhou, X., Wang, J., Lu, C., Liao, Q., Gudda, F. O., & Ling, W. (2020). Antibiotics in animal manure and manure-based fertilizers: Occurrence and ecological risk assessment. Chemosphere, 255, 127006.
[/registrados]