Envejecimiento ovárico en cerdas asociado a estrés oxidativo inducido por PLPP3

El envejecimiento ovárico en las cerdas causa infertilidad y trastornos reproductivos. Factores como el estrés oxidativo, la ferroptosis y la autofagia parecen estar implicados en este proceso, pero los mecanismos subyacentes no se comprenden del todo. Este estudio se ha centrado en identificar los cambios moleculares y genéticos relacionados con el envejecimiento ovárico en cerdas, con el objetivo de aportar conocimiento para el desarrollo de estrategias que ayuden a mitigar sus efectos.

ENVEJECIMIENTO OVÁRICO Y ESTRÉS OXIDATIVO

El envejecimiento ovárico se caracteriza por la reducción del número de folículos y un deterioro de la calidad de los ovocitos, lo que conduce a una disminución gradual de la fertilidad de las hembras^1,2.

 ESTRÉS OXIDATIVO 

En los mamíferos, las causas del envejecimiento ovárico se atribuyen principalmente al desequilibrio de los sistemas antioxidantes³. El estrés oxidativo es el principal impulsor del envejecimiento ovárico:

Disminuyendo la calidad de los ovocitos y provocando disfunción mitocondrial y apoptosis celular⁴.

Desencadenando patologías reproductivas como atresia folicular anormal, menor tasa de fertilización y enfermedades reproductivas⁵.

La acumulación excesiva de especies reactivas del oxígeno (ROS) inducida por el estrés oxidativo provoca la apoptosis de las células de la granulosa (CG)⁶, potencia la degeneración del cuerpo lúteo y conduce a la atresia folicular en las cerdas⁷.

 FERROPTOSIS 

La ferroptosis es una forma de muerte celular no apoptótica dependiente del hierro (Fe) y de las ROS⁸ caracterizada por la acumulación de especies reactivas de oxígeno lipídicas y hierro, formando así hidroperóxidos lipídicos^9,10.

 AUTOFAGIA 

La autofagia, uno de los principales tipos de muerte celular programada¹¹ y muerte celular de tipo II, consiste en la digestión las proteínas mal plegadas en los lisosomas, limpiando los orgánulos dañados, como las mitocondrias y los peroxisomas¹².

De esta forma, mantiene la homeostasis celular y tisular¹³, protegiendo frente al envejecimiento, disminuyendo la actividad autofágica con el envejecimiento natural14.

No obstante, la autofagia excesiva o disfuncional es responsable de la muerte inducida por estrés oxidativo de las CG porcinas^15,16.

Las observaciones realizadas en diversos estudios^17-22 con otros diversos tipos celulares sugieren que el estrés oxidativo podría inducir la ferroptosis y la autofagia para regular el envejecimiento ovárico, pero los mecanismos implicados aún no se han dilucidado.

 FOSFOLÍPIDO FOSFATASA 3 

La fosfolípido fosfatasa 3 (PLPP3) pertenece a la familia de las fosfatasas del ácido fosfatídico y desfosforila los fosfolípidos en productos de señalización lipídica que suelen ser oxidadas por las ROS dando lugar a hidroperóxidos lipídicos²³.

Estudios previos han revelado que los hidroperóxidos lipídicos inducen apoptosis celular, ferroptosis y autofagia^17,24.

Por tanto, la PLPP3 podría estar implicada en el envejecimiento ovárico a través de la regulación del estrés oxidativo, la ferroptosis y la autofagia.

PAPEL DE PLPP3 EN EL ENVEJECIMIENTO OVÁRICO

En este estudio, se trató de explorar las funciones biológicas de PLPP3 en el estrés oxidativo, la ferroptosis y la autofagia en las CG e investigar el papel de PLPP3 en el desarrollo folicular.

Dado que el inicio de la pubertad indica la maduración de los folículos porcinos, se identificaron además las asociaciones entre la edad al inicio de la pubertad y los posibles marcadores moleculares de PLPP3. Estos resultados podrían proporcionar nuevas dianas para las investigaciones sobre el envejecimiento ovárico en mamíferos.

 MATERIALES Y MÉTODOS 

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LAS CG

Para este estudio se utilizaron ovarios envejecidos obtenidos de cerdas sacrificadas (más de 6 partos) y ovarios jóvenes obtenidos de cerdas de 5 meses.

Las células de la granulosa (CG) primarias porcinas se cultivaron para explorar el impacto de la PLPP3 en sus funciones celulares.

También, se les extrajo ARN y proteínas para realizar análisis qRT-PCR y Western Blot, así como el análisis del fenotipo celular y análisis funcional.

DETECCIÓN DE LA PUBERTAD Y ANÁLISIS GENÉTICO

El inicio de la pubertad de las cerdas se identificó mediante la observación del reflejo de inmovilidad y por contacto con los verracos, registrándose los signos de pubertad dos veces al día. Se extrajo ADN de 142 cerdas para calcular la frecuencia de genotipos y la frecuencia alélica de los SNPs en el promotor de PLPP3.

Seguidamente, se realizó el análisis de asociación genética entre los SNPs PLPP3 y de la edad de presentación de la pubertad de las cerdas.

DETECCIÓN ROS, AUTOFAGIA, SA β-GAL, MDA Y FE

Con el fin de caracterizar el estrés oxidativo y envejecimiento celular de las CG se realizaron los siguientes análisis:

• Detección de ROS.
  
• Detección del nivel de autofagia.
  
• Prueba SA β-Gal.
  
• Detección de malondialdehído (MDA).
  
• Detección de hierro (Fe)
  
• Determinación del potencial de membrana mitocondrial
  
• Ensayo Western Blot (WB)

 RESULTADOS 

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LOS OVARIOS

El tamaño