Universidad de Nottingham – Proyecto PROHEALTH (Incluido en el marco del Programa FP7 – KBBE bajo la subvención Nº 613574 para la investigación y desarrollo tecnológico)
La intensificación de la producción porcina ha llevado a la aparición de las llamadas “Enfermedades de la Producción” ocasionadas principalmente por patógenos entéricos y respiratorios, pero que se ven potenciados por otros factores como el estrés o unas condiciones nutricionales o de alojamiento deficientes, conduciendo a grandes pérdidas económicas.
En la primera parte de este artículo se expondrán las principales técnicas de biología molecular empleadas en el diagnóstico de patologías porcinas.
| Los biomarcadores moleculares son moléculas cuya variación indica la presencia de una enfermedad, un cambio fisiológico o una respuesta a un tratamiento. |
La identificación de estos biomarcadores podría tener un gran valor, permitiendo mejorar el diagnóstico y el análisis de riesgos, y establecer cuáles son las mejores prácticas para maximizar el rendimiento y el bienestar de los animales.[registrados]
Anticuerpos vs Genes
Ambas técnicas seguirán empleándose como herramientas de diagnóstico y vigilancia, pero los nuevos avances en tecnología molecular nos permitirán llevar el diagnóstico a otro nivel.
| Existen cambios en los patrones de expresión génica que se pueden relacionar con procesos patológicos en los cerdos.
La detección de estos cambios permitiría adelantarnos en la prevención, aplicando medidas antes de que la enfermedad se manifieste. |
Patrones de Expresión Génica
Las variaciones en los patrones de expresión génica están ganando popularidad como biomarcadores moleculares, ya que en muchos casos se ha podido establecer una conexión entre un patrón concreto y un proceso patológico especifico.
Todos los seres vivos estamos dotados de material genético (ADN o ARN en el caso de algunos virus) que almacena la información necesaria para la síntesis de productos génicos específicos –macromoléculas como proteínas- indispensables para la vida.
Este material genético se compone de miles de genes, cada uno con una secuencia específica de nucleótidos para la síntesis de un producto génico específico, y además toda esta información se encuentra de forma idéntica (salvo algunas excepciones) en todas y cada una de las células somáticas del organismo.
¿Cómo se traduce la información genética en proteínas?
La síntesis proteica consta de un primer paso que tiene lugar en el núcleo de la célula -TRANSCRIPCIÓN de la información del ADN para dar ARN-, y un segundo paso que ocurre en el citoplasma -TRADUCCIÓN de ARN a proteína (Figura 1).
Figura 1. Síntesis proteica a partir del ADN.
Si el material genético de todas las células es idéntico, ¿a qué se debe la gran variabilidad en las células de un solo organismo?
En función de las necesidades puntuales de cada célula, ésta producirá unas moléculas u otras. Para ello, existen mecanismos celulares que silencian o activan un determinado gen, controlando así la síntesis de su producto génico.
Variabilidad de expresión génica
La detección del producto final de la expresión génica –proteínas- es una opción válida, pero a menudo es necesario que alcancen una concentración mínima en el tejido para que sean indicativas de un proceso patológico.
Las células responden ante agresiones externas como patógenos y toxinas, produciendo sustancias como las proteínas de fase aguda. Estas proteínas son útiles para monitorizar la evolución de un proceso inflamatorio, pero su aparición implica que ya se ha producido un daño sin permitir concretar cuál es su causa exacta (patógeno, tóxico, etc.).
Adelantarnos a la enfermedad, incluso antes de que se manifiesten los signos clínicos, será un gran avance para el campo del diagnóstico.
La tendencia de futuro será determinar los patrones de expresión génica, es decir, qué genes se están expresando o silenciando en un animal de forma coordinada ante un estímulo externo.
Determinados patrones se relacionan con daño celular o con el inicio de una respuesta inmunitaria temprana, indicativos de un proceso infeccioso.
Estos patrones de expresión podrían llegar a tener un gran valor diagnóstico predictivo, al poder emplearse para monitorizar la presencia de un patógeno específico o la respuesta durante el transcurso de la enfermedad
Diagnóstico molecular
PCR
La mayoría de las pruebas que se realizan para la detección de patógenos por la presencia de su material genético incluyen, en algún momento, la PCR, Reacción en Cadena de la Polimerasa.
La cantidad de material genético presente en una muestra suele ser muy pequeña y para poder detectarlo directamente es necesario realizar un paso previo de multiplicación o “amplificación” de las copias presentes en la muestra por PCR.
La PCR consiste básicamente en “replicar” in vitro una y otra vez el fragmento de ADN que queremos analizar, emulando lo que ocurre de forma natural en la célula (Figura 2).
CICLO DE AMPLIFICACIÓN
- Desnaturalización del ADN molde: Se aumenta la Tª para que la doble hebra de ADN se separe dando dos hebras simples
- Alineación: Al disminuir la Tª los cebadores se unen a sus respectivas secuencias complementarias en el ADN molde.
- Elongación: Al volver a aumentar la Tª, la ADN polimerasa sintetiza la nueva cadena a partir del cebador, añadiendo nucleótidos complementarios a la secuencia del ADN molde.
Figura 2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Durante la PCR se llevan a cabo numerosos ciclos de amplificación, cada uno de los cuales consta de una fase de desnaturalización, alineación y elongación obteniéndose finalmente millones de copias del fragmento deseado. Para que tenga lugar la reacción de la PCR, se reúnen el ADN molde, ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores, y se somete esta mezcla a variaciones de temperatura con el fin de desencadenar los ciclos de amplificación.Una vez obtenido el producto de PCR, este puede emplearse para obtener información de diversas formas, tanto sobre la presencia u ausencia de un gen específico (por ejemplo, identificación de un patógeno) como de su cantidad. Por ello, existen numerosas variantes de la técnica de PCR, en función del tipo de material genético y de la información que queremos obtener.
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VENTAJAS Y APLICACIONES DE LA PCR
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PCR CLÁSICA
Para la identificación de agentes patógenos conocidos, el producto de la PCR se hace pasar por un gel de electroforesis, que permite separar los fragmentos según su tamaño gracias al uso de cebadores específicos a una especie o una cepa.
Sabiendo cuál es el tamaño del gen de interés, por ejemplo, un gen característico del virus de la Peste Porcina Africana, podemos determinar su presencia.
Se trata de una prueba meramente cualitativa que indica si el material genético está presente o no en nuestra muestra.
RT-PCR
Para la identificación de ARN virus se recurre a la RT-PCR en la que se realiza un paso previo de transcripción inversa.
El ARN es más sensible al calor que el ADN, por lo que se utiliza la enzima transcriptasa inversa para generar una copia del fragmento de ARN en forma de ADN complementario, y a partir de aquí continúa el proceso normal de la PCR.
PCR CUANTITATIVA
La qPCR permite, no solo identificar el ADN de un agente patógeno en una muestra dada, sino que además permite cuantificarlo, de modo que se puede estimar la carga de patógeno presente en el animal (Gráfica 1).
La qPCR se usa de forma rutinaria en el diagnóstico y detección de prácticamente todos los patógenos que afectan al cerdo, muchos de los cuales tienen un gran impacto económico, entre los que se encuentran: la Peste Porcina Clásica (Chander et al., 2014), la Peste Porcina Africana (Oura et al., 2013), el Delta Coronavirus Porcino (PDCoV) (Zhang, 2016), y el Virus de la Diarrea Epidémica Porcina (Diel et al., 2016).
La combinación de la qPCR con tecnología basada en microfluidos (BioMarkTm qPCR System) ha permitido incrementar el rendimiento de esta técnica, ya que se emplea un volumen muy pequeño de reactivos por muestra, pudiendo llevarse a cabo hasta 9216 reacciones de qPCR simultáneamente (Nath et al., 2012).
| A diferencia de la PCR clásica, en el caso de la qPCR, cada vez que se sintetiza una nueva copia de ADN, se incorpora un marcador fluorescente, de forma que al final de cada ciclo se mide la fluorescencia emitida.
El nivel de fluorescencia solo se puede medir cuando el número de copias presentes en la muestra alcanza un umbral mínimo o ciclo umbral (Ct): En función del número de ciclos necesarios para alcanzar este umbral, se calcula cuantas copias había inicialmente en la muestra. Cuantas más copias existan en la muestra inicial, menos ciclos serán necesarios para alcanzar la Ct. Por ejemplo, ante dos muestras (A y B) de la misma bacteria: si con la muestra A se alcanza la Ct en el ciclo 10 y con la muestra B se alcanza en el ciclo 20, sabremos que en la muestra A había mayor carga de bacterias. |
Gráfica 1. Curva de amplificación del ADN
Análisis de microarrays
Un microarray de ADN (Figura 3) consiste en un soporte sólido con miles de moléculas de ADN de cadena simple –sondasordenados formando una matriz de secuencias conocidas en dos dimensiones (López, Mallorquín and Vega García, 2002).
Gracias a esta herramienta se pueden analizar miles de genes que puedan estar simultáneamente en la muestra (Bryant et. al., 2004).
Los microarrays también se emplean para realizar estudios de expresión en los que el ARN celular se traduce a ADNc -ADN complementario-, que posteriormente es amplificado y marcado para su análisis por microarray.
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APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS
Un ejemplo de la aplicación de esta tecnología en medicina veterinaria es el Virochip, un microarray pan-viral capaz de detectar todos los virus conocidos, habiéndose identificado simultáneamente el virus PRRS, Influenzavirus y el coronavirus porcino en muestras séricas (Nicholson et al., 2011). |
Figura 3. Análisis de microarrays.
Secuenciación
La secuenciación –determinación de la secuencia de nucleótidos- de todo el material genético -ADN y ADNc derivado del ARN- presente en la muestra (Figura 4) puede proporcionar información sobre los patógenos presentes, y dependiendo de la muestra, la respuesta del hospedador.
La principal ventaja de la secuenciación es la posibilidad de generar grandes cantidades de información muy detallada (Vayssier- Taussat et al., 2013).
Cualquier ácido nucleico, ya sea del hospedador o del patógeno, presente en una muestra se secuenciará sin que sea necesario conocer previamente la secuencia genómica (Metzker, 2010).
En la segunda parte de este artículo veremos cuáles son los principales biomarcadores identificados en el cerdo y cómo se puede aplicar la tecnología descrita a la producción porcina.
Figura 4. Secuenciación de ADN. Durante la secuenciación, además de los nucleótidos normales, se añaden nucleótidos modificados para que terminen la sintesis de la cadena y que están marcados con fluorocromos (un color para cada nucleótido). Se generan fragmentos de nucleotidos de diferentes longitudes. Al final de cada ciclo, cada fragmento tendrá un tamaño concreto y emitirá una fluorescencia en función del último nucleótido que haya incorporado. De esta forma se obtiene una “escalera” de fragmentos de menor a mayor tamaño que permite establecer la secuencia de toda la muestra analizada.
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