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¿Cómo se realiza una prueba de sensibilidad antibiótica en el laboratorio?

Escrito por: Gema Chacón -

Veterinaria Responsable del Dpto. Diagnóstico en EXOPOL

, Silvia del Caso - Exopol S.L.

Las pruebas de sensibilidad antibiótica, también denominadas antibiogramas, determinan la sensibilidad de un microorganismo frente a un antimicrobiano.

Este tipo de pruebas se realizan in vitro con el propósito de correlacionar los resultados con la práctica clínica.

Existen distintas técnicas para determinar la sensibilidad antibiótica, pero en este artículo comentaremos las más importantes, la técnica de Kirby-Bauer y las técnicas para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI).

 

 

 

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA – BACK TO BASICS

Técnica de Kirby-Bauer o método con discos en difusión en agar

También denominada habitualmente como “antibiograma”, es la técnica más común, considerándose un método cualitativo y, por tanto, menos preciso que uno cuantitativo.

Los resultados que se obtienen son el tamaño de halo y la categorización:

Técnicas para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI)

La CMI indica la concentración más baja de antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano in vitro y, por tanto, se considera una técnica cuantitativa.

Esta técnica permite conocer, además de los antibióticos sensibles, la concentración de antibiótico que debe llegar al órgano diana para que el tratamiento sea efectivo.

Existen varias técnicas:

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA – DE LA TEORÍA A LA PRÁCTICA

En un caso clínico, para poder llevar a cabo estas técnicas, hay que seguir los siguientes pasos:

 DÍA 0. Uno de los pasos más importantes es la toma de muestras y envío al laboratorio  

Se presenta un ejemplo de caso clínico de porcino blanco, donde el animal presentaba incoordinación y signos nerviosos. Para poder realizar un buen diagnóstico hay que [registrados]realizar una correcta toma de muestras y envío al laboratorio.

Es importante seleccionar bien a los animales, que deberán presentar sintomatología y no haber sido tratados con antibióticos previamente.

El envío hay que realizarlo con refrigeración y que llegue al laboratorio en máximo 24 horas.

En este caso se puede enviar la cabeza entera al laboratorio, pero sino es posible realizar el envío de manera rápida, otra opción es realizar la toma de muestras en la granja.

Para ello habría que separar la cabeza del cuello e introducir un hisopo estéril con medio de transporte por el agujero magno.

 DÍA 1. Siembra de la muestra  

Cuando llega la muestra al laboratorio, se siembra en los medios apropiados en función del tipo de muestra y la sospecha etiológica.

En este caso, Agar Sangre Columbia, y se incuba durante 18-24 horas a 37 oC en atmósfera de microaerofilia.

 DÍA 2. Aislamiento microbiológico  

Tras la incubación de las placas, se resembrarán las colonias compatibles con agentes etiológicos para obtener cultivos puros.

  DÍA 3. Una correcta identificación bacteriana permite realizar un buen diagnóstico  

Una vez obtenidos los aislamientos bacterianos en un cultivo puro se procede a su identificación, siendo importante realizar un buen diagnóstico, que sea correcto y completo.

Si en este caso se sospecha de meningitis y en el análisis microbiológico se identifica Escherichia coli, es muy probable que sea una contaminación postmortem.

Hay que confirmar el diagnóstico valorando otras posibles causas de procesos nerviosos más probables, por ejemplo, Streptococcus suis o Glaesserella parasuis.

En esta caso, mediante la tecnología Maldi-Tof, se confirmó S. suis como agente etiológico.

A partir del aislamiento, se prepara el inóculo de la bacteria, ajustándolo a una concentración estandarizada, eligiendo los medios de cultivo apropiados y las condiciones de incubación.

Todos estos aspectos críticos vienen establecidos en protocolos elaborados por organismos oficiales como: Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) y European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).

  PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA  

Técnica de Kirby-Bauer o método con discos en difusión en agar

Se siembra una placa de agar con el inóculo bacteriano.
Sobre esta placa que se colocarán discos impregnados con antibióticos a concentraciones estandarizadas.

Técnica para determinar la CMI mediante el método de microdilución

Se inocula con la bacteria y caldo de cultivo cada pocillo de una placa donde están distribuidas diluciones de menor a mayor concentración de los distintos antibióticos a analizar.

 

Una vez preparado se incubará en las condiciones indicadas en los protocolos en una estufa durante 18-24 horas.

 

  DÍA 4. Lectura e interpretación  

Técnica de Kirby-Bauer 

Tras incubar la placa, se obtiene un halo de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor del disco cuyo diámetro (mm) corresponde con el nivel de sensibilidad frente al antibiótico testado.

Método de microdilución

Se puede apreciar el crecimiento bacteriano como turbidez en el pocillo o con la formación de pellet.

La CMI se identificará con el pocillo con la menor concentración en el que no haya crecimiento bacteriano.

¿Cómo se interpretan los resultados?

Para valorar la sensibilidad se debe comparar el resultado numérico (diámetro de halo en Kirby Bauer o valor CMI) con los puntos de corte clínicos descritos por los organismos oficiales.

De este modo se clasifica la bacteria como sensible, sensibilidad intermedia o resistente, a cada uno de los antibióticos analizados.

El resultado será indicativo de la probabilidad de éxito terapéutico, siguiendo las indicaciones de tratamiento y posología de la ficha técnica del medicamento.

En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de informe con los resultados de Kirby-Bauer y en la Tabla 2 aparecen los del estudio de CMI, ambos resultados de la cepa de S. suis aislada en este caso.

Podemos ver en el listado de antibióticos, que aparece delante del nombre la categoría D, C y B de la clasificación de la Agencia Europea del Medicamento (EMA). Esta clasificación se tiene que tener en cuenta a la hora de elegir el medicamento más adecuado y, por tanto, habría que valorar como primera elección de tratamiento los antibióticos para los que la cepa ha resultado sensible, y que pertenezcan a la categoría de la EMA con menos limitaciones de uso.

¿Por qué no me funciona en el campo el resultado del antibiograma?

Una de las limitaciones de las pruebas de sensibilidad antibiótica es la falta de puntos de corte clínicos, ya que en algunos casos hay que utilizar los descritos para otra especie animal o incluso de humanos.

Cada vez contamos con más puntos de corte y más apropiados, pero a veces esta limitación produce incertidumbre en la interpretación del resultado.

Los resultados de resistencia antibiótica son más predictivos que los de sensibilidad. Si un antibiótico no funciona frente a una bacteria in vitro, lo más probable es que no lo haga in vivo. No obstante, una bacteria puede resultar sensible in vitro sin que se observe el mismo efecto in vivo.

También hay que tener en cuenta que existen otros factores que influyen en la efectividad del tratamiento, como:

Las características farmacocinéticas y farmacodinámicas del antibiótico.
La correcta dosificación y administración del tratamiento.
La edad de los animales.
La respuesta inmunitaria.
La presencia de inflamación.

¿Qué diferencias hay entre antibiograma en disco y CMI?

Técnica de Kirby-Bauer 

Es más económica por su sencillez y muestra si la bacteria es sensible o no a cada antibiótico.

Método de microdilución

Es más preciso al enfrentar a la bacteria a diferentes concentraciones de antibiótico, con lo que se obtiene el valor de la concentración mínima inhibitoria que debe llegar al lugar de la infección.

Ambas técnicas son una gran herramienta para el veterinario, porque ayudan en la elección del tratamiento que tiene más probabilidades de éxito, pero para que sean realmente fiables es necesario que todo el proceso se haya realizado correctamente.

BIBLIOGRAFÍA
CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals. 4th ed. CLSI supplement VET08. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2018.

The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 11.0, 2021. http://www.eucast.org

European Medicines Agency, Clasificación de los antibióticos para uso en animales para un uso prudente y responsable, 2019,

Informe completo del AMEG: https:/bit.ly/30ZEuRi Schwarz, Stefan, et al. Antimicrobial Resistance in Bacteria from Livestock and Companion Animals, ASM Press; 2018.

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