Para leer más contenidos de porciNews Septiembre 2016
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El diagnóstico de procesos diarréicos no es sencillo por diferentes razones:
Resulta imprescindible realizar un estudio diferencial completo que permita detectar todos los agentes implicados y determinar cuál o cuáles son más importantes en el proceso.
Escherichia coli: causa diarreas amarillentas y líquidas que aparecen en las primeras horas o días de vida, y afecta sobre todo a camadas de hembras primerizas. La morbilidad y letalidad es variable pudiendo llegar hasta el 70% en las camadas afectadas.
En animales lactantes las colibacilosis se producen principalmente por cepas toxinogénicas. Las cepas toxinogénicas poseen fimbrias con las que se unen al enterocito (F4, F5, F6 o F41) y producen toxinas causantes de las diarreas (Sta, Stb o LT). Sin embargo, se han descrito casos de colibacilosis por cepas que no poseían los factores de virulencia conocidos hasta el momento (Kim et al. 2010).
Clostridium perfringens: En lechones lactantes los toxinotipos causantes de diarreas son los siguientes:
Clostridium difficile: diarreas en los primeros días de vida. Es característico el edema de mesocolon, pero no siempre se observa. Su efecto patógeno se debe a la producción de dos toxinas; toxina A y toxina B. Es importante la detección de toxinas, puesto que existen cepas no toxinogénicas que no producen diarreas.
PARÁSITOS
Coccidios: Isospora suis, actualmente clasificada como Cystoisospora suis, produce diarreas amarillentas-grisáceas en lechones de 7 a 11 días de vida. Alta morbilidad con baja mortalidad, las pérdidas económicas son debidas a la bajada del rendimiento y la falta de uniformidad de la camada.
VIRUS
Rotavirus: es endémico en las explotaciones, produce diarreas dentro de procesos multifactoriales con otros agentes, siendo de mayor gravedad los cuadros en camadas de primerizas.
PEDV: el virus de la diarrea epidémica porcina es un coronavirus. Afecta a todas las edades (hembras, lechones lactantes y transición) con diarreas muy acuosas y severa deshidratación. La morbilidad es muy alta y la mortalidad puede ser alta en lactación.
TGE: el virus de la gastroenteritis transmisible (TGE), es un coronavirus que produce diarreas severas, vómitos y alta mortalidad. Es muy poco frecuente desde que en los años 80 se extendió el coronavirus respiratorio porcino que produce inmunidad cruzada con el TGE (Paton et al., 1997).
Es fundamental una buena anamnesis y selección de muestras a enviar al laboratorio.
El éxito del diagnóstico depende de que las muestras sean representativas y se encuentren en buen estado de conservación.
1.-Seleccionar 4 o 5 animales de diferentes camadas: así obtenemos una buena representación de la explotación.
2.- Animales en fases iniciales de la diarrea característica del proceso.
En animales con diarreas de varios días de evolución, la presencia de agentes secundarios dificulta valorar la causa desencadenante del proceso.
3.- Animales no tratados. El tratamiento antibiótico puede impedir el aislamiento de agentes bacterianos como E. coli o clostridios.
4.-Animales sacrificados. Evitar muestras de animales que lleven varias horas muertos ya que la autolisis del intestino se produce rápidamente.
Las muestras más apropiadas son los paquetes digestivos que permiten un análisis completo incluyendo el estudio histopatológico.
Las muestras se deben enviar al laboratorio lo antes posible (menos de 24 horas) y en refrigeración. Si no es posible el envío de paquetes digestivos se puede realizar el estudio en muestras de hisopos y heces.
DATOS DEL CASO
Bajas en maternidad a las pocas horas de vida, sospecha de colibacilosis. Envió para su análisis 5 lechones de 2 camadas diferentes que no habían sido tratados con antibióticos.
5 lechones de 2 camadas
OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS DE LESIONES
Los cinco animales presentaban lesiones similares: intestinos delgados congestivos con contenido muy líquido y amarillento (Fotografía 1). Resto de órganos sin lesiones aparentes.
Fotografía 1. Intestinos delgados congestivos con contenido muy líquido y amarillento
Se procedió a realizar las siguientes pruebas:
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Clostridium difficile: los contenidos de mesocolon fueron negativos a la técnica de inmunocromatografía (ICR) específica frente a Cl. difficile (GDH).
TIPIFICACIÓN DE E. COLI
1.-Comparación fenotípica
Se estudiaron 15 aislamientos de E. coli (3 aislamientos por animal) mediante la comparación de un patrón de fermentación de azucares.
En la Figura 2 se puede observar un dendograma con los resultados obtenidos. La línea de puntos representa el punto de corte. Todos los aislamientos que formen un grupo (o clúster) a la derecha de esta línea pertenecen a la misma cepa. En este caso hay 8 grupos, es decir, 8 cepas.
La cepa 5 es la mayoritaria (engloba 10 de los 15 aislamientos) y está presente en 4 de las 5 muestras analizadas.
Figura 2. Comparación fenotípica de aislamientos de E. coli
2.-Detección de factores de virulencia mediante PCR
Tanto las muestras de intestinos delgados como el análisis de la cepa de E. coli mayoritaria (Cepa 5) fueron negativos a los factores de virulencia más importantes en diarreas colibacilares neonatales (F4, F5, F6, F41, Sta, Stb y LT).
DETECCIÓN DE VIRUS
Las muestras fueron negativas a rotavirus y PEDV mediante PCR a tiempo real.
COPROLOGÍAS
Se realizó un estudio coprológico mediante las técnicas de flotación en sulfato de zinc siendo negativa a la presencia de parásitos.
RESUMEN DE RESULTADOS
En la figura 3 se puede observar un resumen de todos los resultados obtenidos.
Figura 3. Resultados globales.
HISTOPATOLOGÍA
Histológicamente en los cinco animales las lesiones observadas fueron similares:
Ligera-moderada congestión de vasos de la mucosa y submucosa. Ligera enteritis con presencia de linfocitos y neutrófilos en las vellosidades intestinales.
Mediante tinción de gram se observaron bacterias Gram negativas compatibles con Escherichia coli adheridas a la membrana de las vellosidades y en menor cantidad bacterias gram positivas de morfología bacilar (compatibles con Clostridium sp.) sin relación con el epitelio.
Fotografía 2. Congestión y enteritis
Con el fin de valorar la importancia de E. coli y Cl. perfringens en el proceso se recomendó el estudio histopatológico de las lesiones (estudio realizado en Micros Veterinaria S.L.).
CONCLUSIÓN DEL CASO
Los resultados globales indican la presencia de enteritis catarral asociada a E. coli como causa de la diarrea. No se detectaron cepas toxinogénicas con los factores de virulencia descritos hasta el momento.
DATOS DEL CASO
Recibimos 5 animales lactantes de 3-4 días de edad con diarreas neonatales.
5 animales lactantes
OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS DE LESIONES
Los 5 lechones presentaban la zona perineal manchada de heces. Estómagos repletos de leche. Intestinos delgados e intestinos gruesos congestivos con contenido semifluido de color amarillento
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Se aisló E. coli en cantidad alta en el intestino delgado de los animales 2, 4 y 5, aislándose en cantidad moderada en los animales 1 y 3.
Mediante ICR se confirmó la presencia de Clostridium difficile en el contenido de mesocolon de los animales 2, 3. Se procedió al cultivo específico comprobando, tras su aislamiento, que se trataba de una cepa toxinogénica (positiva a Toxinas A y B).
Mediante tinción de gram se observaron bacterias compatibles con Clostridium perfringens en poca cantidad en los intestinos delgados de los animales 2, 3 y 4.
TIPIFICACIÓN DE E. COLI:
1.-Comparación fenotípica
Se encontraron 3 cepas mayoritarias de E. coli:
Cepa 5 (azul) engloba dos aislamientos, presente únicamente en la muestra 2
Cepa 6 (verde) engloba seis aislamientos, presente en muestras 3 y 4
Cepa 7 (naranja) engloba 3 aislamientos, presente en muestras 1 y 5.
2.-Detección de factores de virulencia mediante PCR
Se analizaron los factores de virulencia de las 3 cepas mayoritaria así como del pool de intestinos delgados (Tabla 1).
Figura 4. Comparación fenotípica de aislamientos de E. coli
DETECCIÓN DE VIRUS
Las muestras fueron positivas a rotavirus, siendo negativas a PEDV
COPROLOGÍAS
El estudio coprológico fue negativo.
HISTOPATOLOGÍA
El estudio histopatológico de los intestinos delgados mostraron lesiones compatibles con E. coli y rotavirus en uno de los 5 animales. A nivel de intestino grueso se apreciaban lesiones compatible con Clostridium difficile en 3 de los 5 animales analizados.
RESUMEN DE RESULTADOS:
Figura 5: caso 2. Resultados globales.
Tabla1: detección de factores de virulencia mediante qPCR
Sta: Toxina termoestable A, Stb: Toxina termoestable B, LT: toxina termolábil.
GAD: detección de enzima glutamato descarboxilasa presente en todas la cepas de E. coli. Aporta información de la cantidad total de E. coli en la muestra (Arnal y Chacón 2015).
En el pool de intestinos delgados se encontraron las fimbrias F4 y F6 junto a la toxina termoestable A (Sta), lo que sugiere la presencia de cepas toxinogénicas. En la tipificación de las cepa mayoritarias encontramos que la cepa 6 era una cepa toxinogénica (positiva a F4 y Sta), mientras que las cepas 5 y 7 son cepas no toxinogénicas.
CONCLUSIÓN DEL CASO
Los resultados apuntan a un proceso mixto por varios patógenos:
Presencia de Escherichia coli enterotoxigénica (portadora de la fimbria F4 y la toxina Sta).
Clostridium difficile. Las lesiones a nivel histológico junto con el resto de resultados laboratoriales indican que Clostridium difficile juega un papel muy importante en este caso. Se ha confirmado que las cepas aisladas en 2 animales son toxinogénicas (productoras de tóxinas A+B).
Se detectó la presencia de Clostridium perfringens en el intestino delgado de 3 de los 5 lechones. Sin embargo histológicamente no se observaban lesiones asociadas, no considerándolo un agente primario.
Rotavirus: lesiones compatibles en un animal. Si bien es importante tenerlo en cuenta de cara a la prevención de las diarreas, no se considera el agente con más peso en el proceso actual.
DATOS DEL CASO
Explotación de 600 cerdas, diarreas en lechones de 1 a 5 días de vida desde hace año y medio. Alta morbilidad con baja mortalidad, importante pérdida de crecimiento.
600 cerdas
ESTUDIO LABORATORIAL
Se recibe un paquete intestinal. Presenta mucosa congestiva con contenido líquido amarillento tanto en intestino delgado como en intestino grueso. Ganglios mesentéricos aumentados de tamaño pero no congestivos.
Mediante cultivo microbiológico se aisló E. coli y Cl. perfringens en poca cantidad en las muestras de intestino delgado.
Se descartó la presencia de Clostridium difficile, rotavirus, PEDV e Isospora suis.
El estudio histopatológico reveló la presencia de bacterias bacilares gram positivas (compatible con Cl. perfringens) en intestino delgado unido a lesiones en los enterocitos asociadas a procesos enterotóxigénicos. No se observaban bacterias compatibles con E. coli adheridas al epitelio.
Se realizó el toxinotipo de Clostridium perfringens mediante PCR a tiempo real. La cepa aislada correspondía a Clostridium perfringens tipo A, positiva a la toxina β2 (la toxina β2 se asocia a cepas más virulentas). Se realizó el estudio de PCR sobre el contenido del digestivo obteniéndose el mismo resultado, lo que descartó la presencia de otros toxinotipos.
Figura 6.. Resultados globales
CONCLUSIÓN DEL CASO
Cl perfringens tipo A era el principal agente causante del proceso digestivo del animal muestreado. Se recomendó el envío de muestras de otros animales para confirmar el diagnóstico a nivel de explotación.
