Explorando la microbiota y biomarcadores de salud intestinal

El grave inconveniente de la pérdida de integridad intestinal es que se pierde el control de esta absorción, es decir, se rompen las uniones estrechas (TJ por las siglas en inglés de Tight Junctions) que son un conglomerado de proteínas que mantienen unidos los enterocitos entre sí, permitiendo el paso paracelular de elementos como virus, toxinas, bacterias o proteína sin digerir que podrían actuar como antígeno.

Este fenómeno ligado a la pérdida de integridad intestinal conlleva, en la mayoría de los casos, una activación del sistema inmunitario. En unos casos necesaria y en otro no, pero que siempre conlleva el consumo de energía y recursos que se detraen del crecimiento de los cerdos, pudiendo generarse un círculo vicioso que produciría una retroalimentación de esta reacción.

Los principales actores son las células efectoras y las citocinas, como moléculas de señalización. Sabemos que la pérdida de integridad intestinal se relaciona con
sobreexpresiones de IFN-γ, TGFβ, TNFα, entre otras. Estas moléculas dirigirán la respuesta inmunitaria hacia un componente celular, humoral o mixto.

Una de las preguntas clave es, ¿cómo medimos el nivel de integridad intestinal o de activación inmunitaria en el intestino?

Utilizaremos lo que se conoce como biomarcadores. Un biomarcador es cualquier molécula que podamos medir, que cambie en una determinada circunstancia fisiológica o patológica y que sepamos en qué dimensión y sentido cambia (aumentando o disminuyendo).

Otra cuestión es ¿qué matriz usamos para determinar esos biomarcadores?

En este punto podemos usar las más invasivas (tejidos), que requieren el sacrificio del animal, o las invasivas, que son aquellas que requieren una toma de muestras que impliquen agujas, como es la sangre. También existen las técnicas no invasivos, que utilizan matrices obtenidas de forma natural como son las heces o la orina.

Otro elemento a analizar es ¿qué queremos determinar? 

Podemos buscar una proteína o un azúcar, un ARN que nos indique una expresión génica (si el gen para un biomarcador se está expresando más o menos). Incluso podemos suministrar nosotros un elemento con una ruta de absorción conocida para luego determinar cuánta cantidad se ha absorbido.

Esto último es lo que se denomina pruebas de permeabilidad intestinal y permiten estimar si la vía paracelular está más abierta en un grupo de animales que en otro.

En nuestro laboratorio hemos apostado por las muestras mínimamente invasivas por lo que, generalmente, trabajamos con heces, y en ellas  determinamos la cantidad de ARNm que hay para estimar tanto la integridad intestinal (cuantificando el ARNm para las proteínas de las TJ), como la estimulación inmunitaria
(cuantificando el ARNm para las citocinas).

Las heces no nos permitirán establecer específicamente qué ocurre en cada tramo del intestino, pero son un indicador del estado general del mismo y se han utilizado ampliamente con anterioridad en distintas experimentaciones (Ramis et al., 2023; Sánchez-Uribe et al., 2022; Bravo de Laguna et al., 2022; Ramis et al., 2022; de Groot et al., 2021; de Groot et al., 2022).

¿QUÉ DEBEMOS SABER DE LOS BIOMARCADORES DE SALUD INTESTINAL?

Y ahora, hablemos de biomarcadores. Para empezar, definamos un biomarcador: será toda molécula que cambie alguna circunstancia fisiológica y  patológica.

Potencialmente, toda molécula podría ser un biomarcador siempre y cuando sepamos:

• En qué circunstancias cambia; si aumenta o disminuye dependiendo de esa circunstancia, en qué dimensión cambia y si hay un umbral que nos permita saber si se está produciendo ese cambio.
• Además, debería ser fácil de determinar, barato y que siempre produzca el mismo resultado ante el mismo cambio. Esto es realmente difícil y por eso solo hay unas pocas moléculas que nos permitan usarlas como biomarcadores.

ARNm

En nuestro caso, para determinar la integridad y permeabilidad intestinal, usamos el ARNm de las proteínas de uniones estrechas.
Si usáramos la propia proteína, podríamos encontrarla en sangre dado que cuando se rompen las TJ una parte de esta proteína se trasloca y la encontraríamos aumentada.

Sin embargo, al estudiar el ARNm, esperamos encontrar mayor cantidad en los animales que mejor integridad intestinal tengan, dado que una cantidad alta de ARNm indicaría que se produce una reposición adecuada de estas proteínas.
Entre estas estudiamos la zonulina, ocludina y claudina como tres de las más importantes entre todas las que componen las TJ.

CALPROTECTINA

Otro biomarcador interesante que se usa ampliamente en humanos es la calprotectina. Esta proteína se encuentra en macrófagos y neutrófilos, por lo que es un indicador de infiltrado celular en la mucosa intestinal.
En este caso se puede determinar la proteína o el ARNm en las heces. El problema de la proteína es que no existe un estándar establecido en cerdos o un umbral que indique que la infiltración celular es elevada, cosa que sí se tiene en humanos.

CITOCINAS

Finalmente, tenemos todas las citocinas, que serían un indicador de activación inmunitaria y que incluso nos permitiría determinar si está predominando la
inmunidad innata, la Th1, la Th2, o hay una reacción mixta.

Entre estas tendremos las principales proinflamatorias (IFNα, IFNγ, IL1α, Il1β, IL4, IL6, IL8, TNFα) o antiinflamatorias (TGFβ o IL10). La relación entre ambos
grupos nos permitirá establecer si el animal está en una situación proinflamatoria y antiinflamatoria.

Estos biomarcadores nos han permitido saber qué cambios se producen cuando se usan elementos de protección como el óxido de zinc, las vacunas, distintos
aditivos como enzimas, lignanos, fermentados de cereal o incluso fuentes de zinc alternativas, como los quelados o los microencapsulados, así como numerosos
aditivos naturales (polifenoles, triterpenos,  distinto ácidos orgánicos) y, como no, probióticos, prebióticos y simbióticos.

TODO SOBRE LA MICROBIOTA biomarcadores

Hoy en día, la microbiota constituye uno de los principales focos de estudio en humanos y animales. El conjunto del mamífero y todas estas especies de bacterias, virus, levadura, hongos e incluso protozoos tiene una interrelación muy profunda y el equilibrio entre ellos, el hospedador, el ambiente y la nutrición, es crítica para que el animal esté en un estado de salud adecuado. Y además interaccionan con el medioambiente de una forma definitiva.

Desde hace algún tiempo se empieza a manejar el concepto de “holobionte” y ya no entendemos un cerdo como individuo sino como un conjunto de relaciones con todas las especies que alberga dicho mamífero en la piel, boca, digestivo, respiratorio, piel, vagina, etc. que pueden llegar a ser entre 500 y 1.000.

El conjunto del mamífero y todas estas especies de bacterias, virus, levadura, hongos e incluso protozoos tiene una interrelación muy profunda y el equilibrio
entre ellos, el hospedador, el ambiente y la nutrición, es crítica para que el animal esté en un estado de salud adecuado. Y además interaccionan con el medioambiente de una forma definitiva.

Se han hecho numerosos estudios de microbiota y a veces obtener información de estos estudios es complicado. Hoy tenemos claro que la diversidad es crítica para que el equilibrio con el mamífero sea adecuado.

Pero también sabemos que cambia muy rápido y que incluso se pueden establecer ritmos circadianos en la predominancia de determinadas especies o incluso variedades dentro de una misma especie.

¿CÓMO RELACIONAMOS ESTO CON LA INTEGRIDAD INTESTINAL Y LOS BIOMARCADORES?

Parece claro que la composición de la microbiota es clave para mantener la salud intestinal, empezando por mantener la integridad intestinal. De hecho, el concepto
de desequilibrio o disbiosis lo manejamos hace décadas.

Cuando se produce un desequilibrio entre las especies que son saprofitas y aquellas que son potencialmente patógenas. Estas últimas son capaces de proliferar en exceso y ejercer su acción patogénica.

Y en algunos casos esto empieza por una pérdida de integridad intestinal, producida por la propia disbiosis o inducida por ella.

Es complicado establecer una relación entre microbiota y TJ, y no hay mucha bibliografía al respecto, pero sin duda, esta relación debe existir.
No en vano, tenemos indicadores indirectos de que un mal estado de salud intestinal propiciado por especies como E. coli influye directamente en la integridad intestinal:

El ejemplo del incremento de estreptococias cuando tenemos problemas de colibacilosis o cuando se retiraron los antibióticos preventivos frente a esta enfermedad es un ejemplo clave. Sabemos que S. suis utiliza la translocación a través de un intestino débil para alcanzar sus tejidos diana. Pero aún no tenemos claro qué familias y qué género son especies que tienen una influencia directa sobre estas TJ.

Al igual que estamos en el momento de empezar a ver vacunas Smart, donde se busquen específicamente las cepas que tiene una granja y se incluyan solo esos
antígenos, estamos a punto de iniciar la revolución de la probiosis dirigida y específica:

Conocer qué microbiota tienen los animales que mejor producen y mejor integridad intestinal muestran nos permitirá seleccionar cepas de bacterias o levaduras
presentes en estos animales y ausentes en los enfermos o los que peor produzcan, cultivarlas y suministrarlas a los lechones. Pero esto es una historia para el
futuro…

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