Para leer más contenidos de Revista porciNews Septiembre 2019
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Una de las consecuencias de las patologías digestivas es el desarrollo de inflamación que suele conllevar alteraciones morfológicas, normalmente por el acúmulo de células relacionadas con la inflamación. A este acúmulo celular lo denominamos infiltrado inflamatorio y puede estar constituido por distintas estirpes celulares inmunitarias y, en ocasiones, por la aparición de otros materiales como fibrina.
La presencia de estas células está relacionada con dificultades en la absorción de nutrientes, por la interposición de las células entre los enterocitos donde se absorbe y los vasos sanguíneos y linfáticos encargados de movilizar los nutrientes. Y, por tanto, la presencia de infiltrado se ha utilizado como indicador del estado de salud intestinal. Sin embargo, también pueden ser elementos necesarios para el establecimiento de reacciones inmunes eficientes frente a los patógenos.
Animales y pruebas
Se utilizaron animales Duroc x (Large White x Landrace), vacunados y revacunados frente a E. coli con Colidex-C a los 10 y 20 días de vida (V10-20), comparándose en todas las ocasiones con un grupo contemporáneo no vacunado (C10-20).
Datos productivos
Mortalidad y morbilidad
Aislamientos de E. coli en muestras de heces y de tejido intestinal (incluyendo la presencia de genes de virulencia)
Para evaluar la respuesta inmunitaria se estudiaron dos aspectos:
El infiltrado inflamatorio presente en la lámina propia intestinal.
La expresión génica para la generación de citocinas en el intestino (IFN-α, IFN-γ, IL1-α, IL10, IL12 p35, IL12 p40, TGF-β y TNF-α).
Para el estudio histopatológico, se tomaron muestras de yeyuno, íleon, ciego, colon y nódulos linfáticos mesentéricos de los grupos V10-20 y C10-20 (n=20 de cada grupo).
De cada tramo se tomaron segmentos de 3-5 cm de longitud, abiertos longitudinalmente para la correcta fijación del tejido mediante formol tamponado al 10%.
Se estudió la presencia de lesiones histopatológicas en íleon y colon. Se utilizó el infiltrado celular a nivel de la mucosa como parámetro para la valoración de lesiones intestinales.
Con el fin de poder realizar un estudio comparativo entre los animales vacunados y controles, se valoró el infiltrado celular siguiendo el criterio numérico donde:
Además, se detectaron las células productoras de IgA como elementos específicos del infiltrado, para evaluar la capacidad de producción de IgA, fundamental en la protección de mucosas. Se utilizó para ello la técnica inmunocitoquímica para marcar las células mencionadas.
Resultados
Las lesiones histopatológicas intestinales observadas fueron:
La frecuencia observada de cada una de las categorías de infiltrado inflamatorio en cada grupo experimental se muestra en la Figura 2.
EN LOS ANIMALES VACUNADOS:
El 55% presentaron un infiltrado celular moderado
El 40% de los cerdos tenían un infiltrado celular alto
Tan solo el 5% fueron clasificados como infiltrado celular bajo
EN LOS CONTROLES:
La mayoría de los cerdos presentaron un infiltrado celular moderado (65%) Solo el 10% de los animales tuvieron un infiltrado celular alto
El 25% se clasificaron como infiltrado celular bajo
Para hacer comparaciones estadísticas entre los animales vacunados y controles se calculó la mediana de las puntuaciones obtenidas por cada uno de ellos (Figura 3).
La mediana obtenida fue mayor en los animales vacunados (2,35) que en los animales control (1,85). El estudio estadístico reveló que la diferencia fue significativa (p=0,0289).
Los resultados del estudio histopatológico mostraron que tanto los lechones vacunados como los lechones del grupo control presentaron infiltrado inflamatorio de linfocitos y células plasmáticas, siendo éste clasificado como moderado a alto en la mayoría de los animales. El grupo vacunado presentó un mayor grado de infiltrado que el grupo no vacunado (p=0,035).
En cuanto a las células productoras de IgA, se registró un mayor número de éstas en los animales vacunados, siendo significativa la diferencia con los respectivos controles (p<0,01).
a media de células productoras de IgA fue 25,78±0,84 y 10,38±0,41 para los vacunados y control, respectivamente.
Al relacionar el grado de infiltrado con la presencia de células productoras IgA, se observó que el número de éstas en cada animal fue proporcional a la cantidad de infiltrado inflamatorio (p<0,001). La abundancia de células plasmáticas observada en el infiltrado podría ser un efecto derivado de la vacunación y se correlaciona con el mayor número de células marcadas para IgA en los animales vacunados.
La observación de la expresión génica mostró que los intestinos de los lechones vacunados tenían más ARNm para IFN-α (p<0,001), TNF-α ( p<0,005), TGF-β (p=0,001) e IL 12 p35 (p= 0,009) que los intestinos de los animales control.
Al establecer una correlación entre la expresión génica para las distintas citocinas no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión génica de las distintas citocinas en relación a la puntuación de infiltrado inflamatorio, excepto para TGF-β al comparar la categoría 2 y 3 de infiltrado (p=0,018) (Figura 5). El TGF-β parece tener un papel destacado, favoreciendo que los linfocitos B cambien el isotipo de IgA lo que puede ser motivo del aumento de esta citocina en este estudio. Se observó una correlación positiva entre la expresión génica de esta citocina y la presencia de células productoras de IgA.
Cuando se comparó la cantidad de células productoras de IgA con la expresión génica normalizada de IFN-α, TNF-α, TGF-β, IL-12 p35 se obtuvieron correlaciones positivas con las 3 primeras y negativa con IL-12p35 (r = 0,390; p=0,010, r = 0,384; p=0,011, r = 0,500; p=0,01 y r = -0,315; p=0,039, respectivamente).
Tomando todos los datos en conjunto, la diferencia entre los grupos podría ser debido a una movilización más intensa de linfocitos a la mucosa intestinal de los animales que, una vez inmunizados recibieran continuos contactos con antígenos de E. coli presentes en el ambiente de la granja.
Un dato interesante es que los animales vacunados, con más infiltrado inflamatorio, fueron los que menos frecuencia de aislamiento de E. coli tuvieron y además fueron los que mejores índices productivos obtuvieron (disminución de 176 g en el índice de transformación, por ejemplo).
Por tanto, la presencia de células inflamatorias más parece un reclutamiento activo de células a la zona para mantener la reacción local que un evento patológico.
Los animales vacunados tenían más ARNm para IFN-α y TNF-α, ambas responsables de reclutamiento celular. TNF-α también es responsable de la activación de linfocitos T y B y además TGF-β provoca el cambio de isotipo de las células B a células plasmáticas productoras de IgA.
CONCLUSIONES
La vacunación frente a E. coli con Colidex-C produce una reacción local en el intestino de los animales, duradera (se puede identificar aún al sacrificio), con reclutamiento celular que causa un incremento en el infiltrado celular en el intestino, y con aumento en la producción de citocinas y de células productoras de IgA.
Estos eventos están relacionados entre sí y probablemente son los responsables del estado de protección que conllevó menor morbilidad, menor mortalidad y mejor índice productivo, así como otros efectos como menor frecuencia de aislamiento de la bacteria, con cepas aisladas menos virulentas, e incluso una disminución en otros patógenos como Lawsonia intracellularis.
El incremento de citocinas indica no solo una estimulación de la respuesta humoral sino también de la inmunidad celular. Y esto es exactamente lo que se pretendía con la vacunación.
