El inicio de la infección por Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) sigue siendo una fase clave para entender el desarrollo de la diarrea postdestete. Aunque los mecanismos de patogénesis están bien descritos, todavía existen lagunas en la comprensión de las primeras respuestas intestinales tras la infección, especialmente a nivel epitelial. En este contexto, el presente estudio analiza cómo ETEC F18 se adhiere al intestino y cómo esta interacción temprana afecta a la función intestinal y a la dinámica celular, aportando nuevas claves para entender el inicio del proceso diarreico.
ETEC F18: UN PROBLEMA CLAVE EN EL POSTDESTETE
E. coli enterotoxigénica es una de las principales causas de diarrea postdestete (DPD) y enfermedad de los edemas (ED) en lechones, generando importantes pérdidas económicas debido a la mortalidad, morbilidad, reducción del crecimiento y aumento de los costes de medicación.
FACTORES DE VIRULENCIA: CÓMO ACTÚA ETEC
El tipo de fimbria y el perfil de enterotoxinas son los dos factores clave de virulencia en la enfermedad por ETEC.
| Fimbrias
Entre los lechones afectados por DPD, los tipos de fimbrias adhesivas más frecuentes son:
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Enterotoxinas
Las principales enterotoxinas de ETEC F18 incluyen:
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DE LA INFECCIÓN A LA DIARREA: QUÉ OCURRE EN EL INTESTINO
Los signos clínicos de la DPD y la ED inducidas por ETEC F18 suelen manifestarse entre las 2 y 3 semanas tras el destete y pueden prolongarse hasta 10 días.
Diversos estudios han empleado distintas dosis de inoculación de ETEC F18 para reproducir esta enfermedad en lechones.
Luise et al. (2019) señalaron que, aunque los animales pueden desarrollar diarrea, existe una elevada variabilidad en la gravedad e incidencia, lo que probablemente se deba a diferencias entre estudios en la susceptibilidad genética asociada:
- El gen α(1,2)-fucosiltransferasa (FUT1).
- La competencia inmunitaria.
- La edad.
- La exposición natural a E. coli procedente de la cerda, del entorno o de ambos.
Tras la ingestión oral de ETEC F18, las fimbrias se adhieren a receptores específicos en la membrana apical de los enterocitos.
Las enterotoxinas inducen la acumulación de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), lo que provoca alteraciones en la función del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) en los enterocitos, generando desequilibrios en los electrolitos y en el flujo de agua en el intestino delgado.
EL GRADO DE ADHESIÓN EPITELIAL DE ETEC F18 DETERMINA LA GRAVEDAD DE LA ENFERMEDAD
Otro de los efectos comúnmente descritos de la enfermedad por ETEC en porcino es la alteración de la morfología intestinal:
- Disminución de la altura de las vellosidades.
- Aumento de la profundidad de las criptas.
- Cambios en la integridad de la barrera intestinal, ya sea por un incremento de la permeabilidad transcelular y paracelular o por la disrupción de las proteínas de las uniones estrechas.
Estudios previos han descrito aumentos de IL-6, IL-8 y TNF-α en el intestino delgado de lechones, lo que sugiere una respuesta inflamatoria que puede agravar el daño epitelial y contribuir a la disfunción intestinal.
La proliferación, maduración y diferenciación de las células epiteliales intestinales, reguladas por las vías de señalización Notch y Wnt, son esenciales para mantener y restaurar la función y la integridad del intestino.
EVALUACIÓN DE LA INFECCIÓN TEMPRANA POR ETEC F18
A pesar de que los mecanismos de patogénesis de ETEC están bien establecidos, las respuestas epiteliales y funcionales tempranas tras la adhesión de ETEC F18 siguen estando poco caracterizadas.
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Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de distintas dosis de desafío oral con ETEC F18 sobre su adhesión al epitelio intestinal y sobre diversos indicadores de función intestinal en lechones durante un periodo de 5 días. Además, se analizó el impacto de la infección temprana sobre marcadores de proliferación, diferenciación y renovación de las células epiteliales. Se planteó la hipótesis de que un aumento en la dosis de desafío favorecería una mayor adhesión de ETEC F18 al epitelio intestinal, comprometiendo la función, la integridad y la renovación epitelial, y dando lugar a una mayor incidencia de diarrea y a una reducción del rendimiento productivo en lechones. |
MATERIALES Y MÉTODOS
ANIMALES Y DISEÑO EXPERIMENTAL
Durante el estudio se distribuyeron 24 lechones recién destetados en cuatro grupos experimentales: un grupo control no inoculado y tres grupos desafiados con distintas dosis de ETEC F18 (10⁷, 10⁸ y 10⁹ UFC/ml).
- Se controlaron parámetros productivos (consumo de pienso y el crecimiento) y la consistencia fecal mediante un sistema de puntuación diaria.
- Se tuvo en cuenta la susceptibilidad genética de los animales (gen FUT1) y se mantuvieron condiciones controladas de alojamiento y alimentación sin uso de antimicrobianos.
TOMA DE MUESTRAS Y ANÁLISIS
Se obtuvieron muestras fecales en distintos momentos del ensayo (antes y después de la inoculación) para evaluar la evolución de la infección.
Al final del estudio (5 días postinoculación), los animales fueron sacrificados y se obtuvieron muestras de contenido intestinal y tejidos, especialmente del íleon, para analizar la presencia de ETEC (genes F18 y LT) mediante PCR.
Además, se tomaron muestras de yeyuno, íleon y colon para estudios histológicos, y se midió el pH del contenido digestivo en diferentes segmentos del tracto gastrointestinal. Parte del tejido ileal también se conservó para análisis posteriores relacionados con la función intestinal.
EVALUACIÓN DE LA INTEGRIDAD Y FUNCIÓN DE LA BARRERA INTESTINAL
Se evaluó la integridad de la barrera intestinal y la función del íleon mediante el uso de cámaras de Ussing con tejido fresco obtenido tras el sacrificio. Este sistema permitió medir:
- La resistencia transepitelial (TER).
- La permeabilidad intestinal.
- El transporte activo de nutrientes como glucosa y glutamina.
ESTOS ANÁLISIS EX VIVO SE UTILIZARON PARA DETERMINAR POSIBLES ALTERACIONES EN LA FUNCIÓN Y LA INTEGRIDAD DEL EPITELIO INTESTINAL TRAS EL DESAFÍO CON ETEC F18
ANÁLISIS ESTRUCTURAL Y CELULAR DEL INTESTINO
Se evaluó la morfología intestinal en yeyuno, íleon y colon mediante análisis histológico, midiendo la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas para calcular su relación.
Además, se utilizaron técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para analizar la proliferación celular (Ki67) y la secreción de cloro asociada a CFTR en los distintos segmentos intestinales.
Por otro lado, se aplicó hibridación in situ (ISH) para detectar y cuantificar la adhesión de ETEC F18 al epitelio intestinal, permitiendo localizar la presencia bacteriana directamente en los tejidos.
ABUNDANCIA GÉNICA
Se analizaron muestras fecales y de contenido ileal para cuantificar la presencia de ETEC mediante PCR, determinando la abundancia de los genes F18 y LT. Además, se evaluó la expresión génica en tejido ileal mediante RT-qPCR, tras la extracción de ARN y su conversión a ADNc.
RESULTADOS
ESTADO SANITARIO, PUNTUACIÓN FECAL Y CARGA DE ETEC F18
En comparación con el grupo control (NC), todos los lechones desafiados con ETEC presentaron puntuaciones fecales significativamente más altas, indicativas de diarrea, siendo el grupo 10⁸ el que mostró una mayor incidencia media diaria (Gráfica 1).
Para confirmar el desafío con ETEC F18, se analizó la abundancia de los genes F18 y LT en contenido ileal y fecal a los 5 días postinoculación mediante PCR (Gráfica 2).
- La abundancia de F18 en el íleon fue mayor en todos los grupos desafiados respecto al control, destacando los grupos 10⁷ y 10⁹.
- La abundancia de la toxina LT en el íleon también fue superior en los grupos desafiados.
- En las heces, tanto F18 como LT mostraron niveles más elevados en los grupos infectados, sin diferencias claras entre las distintas dosis.
Para que la enfermedad se manifieste plenamente, es necesario que ETEC F18 se adhiera al epitelio intestinal. Mediante ISH se cuantificó esta adhesión en yeyuno, íleon y colon a los 5 días postinoculación.
Los lechones desafiados mostraron una mayor presencia de F18 en el epitelio intestinal, especialmente en el íleon, donde la localización fue significativamente superior a la del grupo control (Figura 1).
EN CONJUNTO, EL DESAFÍO CON ETEC DIO LUGAR A UN AUMENTO MUY MARCADO DE LA ADHESIÓN BACTERIANA EN EL ÍLEON
RENDIMIENTO PRODUCTIVO
El peso corporal de los lechones no mostró diferencias entre tratamientos antes del desafío. Tampoco se observaron cambios en la ganancia media diaria (GMD), el consumo de pienso ni en la eficiencia alimentaria durante el periodo experimental.
Sin embargo, tras el desafío, la GMD tendió a ser menor en el grupo desafiado con 10⁸ UFC en comparación con el resto de grupos, aunque sin alcanzar diferencias significativas.
A los 5 días postinoculación se observaron algunos cambios en el pH gastrointestinal.
- El pH gástrico fue mayor en los grupos 10⁷ y 10⁹.
- El pH ileal tendió a incrementarse en los animales desafiados, especialmente en el grupo 10⁹.
- No se detectaron diferencias en el pH del yeyuno ni del colon.
A nivel morfología intestinal, se observó una reducción de la altura de las vellosidades en el yeyuno en los grupos 10⁸ y 10⁹, junto con una disminución de la relación vellosidad:cripta en los animales desafiados, lo que sugiere una alteración de la maduración epitelial. Sin embargo, no se detectaron cambios en la morfología del íleon ni en la profundidad de las criptas.
En cuanto a la función secretora, la abundancia de la proteína CFTR aumentó en yeyuno, íleon y colon en los lechones desafiados (Figura 2), especialmente en los grupos de mayor dosis, lo que es consistente con el aumento de la diarrea observado.
Por otro lado, el marcador de proliferación celular Ki67 no mostró cambios en el yeyuno, pero tendió a disminuir en el íleon en el grupo 10⁹, lo que sugiere una posible reducción en la renovación epitelial (Figura 3).
| A pesar de estos cambios, la integridad de la barrera intestinal y el transporte de nutrientes (glucosa y glutamina) no se vieron afectados, lo que indica que, en esta fase temprana de la infección, la función intestinal se mantiene preservada. |
EXPRESIÓN GÉNICA EN ÍLEON
La infección por ETEC F18 provocó algunos cambios en la expresión de genes relacionados con el transporte y la función intestinal.
En relación con la renovación epitelial, no se detectaron cambios en los principales marcadores de proliferación celular. Sin embargo, se observaron alteraciones en la vía de señalización Notch, con una tendencia a mayor expresión de Notch y menor de Hes1, lo que sugiere posibles cambios en los procesos de diferenciación celular.
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En conjunto, estos resultados indican que, aunque la infección modula algunos mecanismos funcionales y de regulación celular, los cambios a nivel génico son limitados en esta fase temprana del proceso. |
DISCUSIÓN
Los estudios de desafío con ETEC F18 han empleado un amplio rango de dosis de inoculación, generalmente entre 10⁸ y 10¹¹ UFC, lo que suele dar lugar a una menor consistencia fecal y a la aparición de diarrea. Sin embargo, existe una gran variabilidad entre estudios en cuanto a la incidencia, gravedad y duración de la diarrea.
A pesar de ello, la relación entre la carga de ETEC F18, su adhesión al epitelio y sus efectos posteriores sobre la función intestinal, la integridad y la dinámica epitelial —incluyendo proliferación, diferenciación y renovación— sigue estando poco caracterizada.
MODELO EXPERIMENTAL Y APARICIÓN DE LA DIARREA
La mayoría de los estudios con ETEC F18 tienen una duración de entre 13 y 21 días, en línea con el hecho de que la diarrea postdestete suele aparecer entre 2 y 3 semanas tras el destete, alcanzando su pico entre los días 2 y 6 postinoculación.
En este trabajo, se realizó un desafío de 5 días en lechones a los 10 días postdestete, utilizando distintas dosis de inoculación, observándose diarrea entre los días 3 y 5 postinoculación, especialmente en los animales que recibieron la dosis de 10⁸ UFC, en concordancia con estudios previos.
CFTR Y MECANISMOS DE SECRECIÓN
En estudios con ETEC K88 se ha descrito un aumento simultáneo de la expresión de ARNm y proteína de CFTR.
En el presente estudio, la expresión de ARNm de CFTR en el íleon tendió a ser mayor en los lechones desafiados con 10⁹ UFC y menor en los que recibieron 10⁸ UFC. Sin embargo, la abundancia de proteína CFTR en el epitelio aumentó en todos los animales desafiados, especialmente en el íleon.
Se sabe que las enterotoxinas de ETEC F18 inducen diarrea secretora mediante la secreción de cloro y agua dependiente de AMPc a través de CFTR. Una vez dentro de los enterocitos, estas toxinas activan los canales CFTR mediante la fosforilación de proteínas reguladoras, lo que incrementa la secreción de cloro y bicarbonato hacia la luz intestinal y provoca un flujo osmótico de agua que contribuye a la diarrea.
| Estos resultados sugieren que la funcionalidad de CFTR en presencia de ETEC F18 no siempre está directamente relacionada con su expresión a nivel génico. |
En línea con el aumento de la localización de CFTR en el epitelio y de la secreción de iones, el pH luminal del íleon tendió a ser más alcalino en los lechones desafiados en comparación con el grupo control.
UN ENTORNO MENOS ÁCIDO PODRÍA FAVORECER LA COLONIZACIÓN POR ETEC Y CONTRIBUIR AL DESARROLLO DE LA DIARREA POSTDESTETE
MEJORANDO LA DETECCIÓN DE ETEC EN TEJIDO
La confirmación de la diarrea postdestete inducida por ETEC F18 requiere el aislamiento de E. coli hemolítica y la detección de fimbrias F18 y genes de enterotoxinas. En este estudio, el uso combinado de qPCR para cuantificar los genes F18 y LT en heces e íleon, junto con la ISH para localizar estos genes en el tejido intestinal, permitió mejorar la precisión diagnóstica.
Tal como se planteaba en la hipótesis, la abundancia del gen F18 en heces fue mayor en los lechones desafiados, confirmando la colonización. Aunque métodos habituales como el cultivo fecal o la PCR de genes como FedA permiten validar el modelo de infección, no aportan información sobre la localización bacteriana.
En este sentido, la ISH permitió demostrar que la adhesión de ETEC F18 al epitelio intestinal aumentó en los animales desafiados, especialmente en el íleon, que se confirmó como el principal sitio de colonización.
ESTOS RESULTADOS DESTACAN EL VALOR DE COMBINAR TÉCNICAS MOLECULARES Y DE LOCALIZACIÓN TISULAR PARA MEJORAR LA COMPRENSIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE LA DIARREA POSTDESTETE
IMPACTO SOBRE LA ESTRUCTURA INTESTINAL
Aunque ETEC F18 provoca principalmente diarrea secretora mediante la liberación de enterotoxinas, también puede alterar de forma significativa los procesos de renovación del epitelio intestinal, comprometiendo la función, la integridad y la capacidad de recuperación de la barrera intestinal.
La infección suele dar lugar a atrofia de las vellosidades e hiperplasia de las criptas, ya que las vellosidades dañadas se desprenden y las células de las criptas aumentan su proliferación como mecanismo compensatorio.
| En este estudio, se observó atrofia en el yeyuno y una disminución de la relación vellosidad:cripta tras 5 días de desafío con ETEC F18. Sin embargo, a pesar de que el íleon fue el principal sitio de adhesión bacteriana, no se detectaron cambios en estos parámetros en comparación con el grupo control. |
ALTERACIONES EN LA RENOVACIÓN EPITELIAL
Tras el daño del epitelio intestinal, la proliferación de las células de las criptas puede activarse como respuesta regenerativa para restaurar la integridad y la función del intestino. Esta actividad proliferativa se evalúa habitualmente mediante la tinción de Ki67, un marcador nuclear que identifica células en división activa.
| La atrofia de las vellosidades y la reducción de la proliferación en respuesta a la infección por ETEC ya han sido descritas previamente y se asocian a daño epitelial mediado por enterotoxinas, al estrés del destete y a la acción de citoquinas inflamatorias. |
La vía de señalización Notch, implicada en la diferenciación celular, mostró signos de alteración.
- La expresión de Notch aumentó en el íleon de los lechones desafiados, especialmente en los grupos 10⁷ y 10⁸, mientras que en el grupo 10⁹ el incremento fue más moderado.
- La expresión de Hes1, un efector clave de esta vía, se redujo, especialmente en el grupo 10⁹.
Este patrón sugiere que a dosis intermedias podrían activarse mecanismos compensatorios para mantener la homeostasis epitelial, mientras que a dosis más altas se superaría la capacidad adaptativa del tejido, alterando la señalización y la renovación epitelial.
| En conjunto, estos resultados refuerzan la idea de que los patógenos entéricos pueden interferir en la señalización epitelial y en los mecanismos de renovación celular a través de procesos inflamatorios, estrés oxidativo y alteraciones en la barrera intestinal. |
TRANSPORTE DE NUTRIENTES Y FUNCIONALIDAD INTESTINAL
Los enterocitos inmaduros procedentes de las criptas intestinales presentan una menor expresión de enzimas digestivas y transportadores de nutrientes, lo que limita la capacidad de digestión y absorción.
Esta inmadurez, especialmente tras daño epitelial o un recambio acelerado, puede favorecer la malabsorción y la aparición de diarrea osmótica. Además, la expresión y actividad de los transportadores de nutrientes pueden verse alteradas por la infección y el estrés fisiológico.
En este estudio, los lechones desafiados con ETEC F18 mostraron un aumento en la expresión del transportador SGLT1 en el íleon. Sin embargo, este incremento no se tradujo en cambios en el transporte funcional de glucosa o glutamina, lo que sugiere una desconexión entre la expresión génica y la funcionalidad o una maduración incompleta de los enterocitos.
EN FASES TEMPRANAS, LA DIARREA INDUCIDA POR ETEC F18 ESTARÍA MÁS RELACIONADA CON MECANISMOS SECRETORES MEDIADOS POR ENTEROTOXINAS QUE CON UN DAÑO ESTRUCTURAL DIRECTO DE LA BARRERA INTESTINAL
CONCLUSIÓN
En línea con la hipótesis planteada, este estudio demuestra que un desafío de 5 días con ETEC F18 incrementa la diarrea y la adhesión bacteriana, especialmente en el íleon.
Si bien, la integridad de la barrera intestinal y el rendimiento productivo no se vieron comprometidos en esta fase temprana de la infección, a nivel celular, se observaron cambios en marcadores de proliferación y en la vía de señalización Notch, lo que sugiere una alteración inicial de la homeostasis epitelial.
| En conjunto, los resultados apoyan un modelo en el que la diarrea inducida por ETEC F18 se debe principalmente a mecanismos secretores mediados por enterotoxinas y CFTR, más que a un daño estructural del epitelio intestinal. Además, estudios de mayor duración podrían ser necesarios para evaluar completamente el impacto de esta infección sobre la regeneración epitelial, la integridad intestinal y el crecimiento de los lechones. |
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