Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial

Existem vários pontos-chave para realização de um bom diagnóstico:

Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial

1. Amostra representativa: Seleção de amostras representativas de animais com sintomas e que não receberam tratamento com antibióticos. Evite coletar amostras de animais com muitas horas de registro do óbito, para que não haja contaminação (autólise ou invasão post-mortem).
2. Precisão e Precaução: A amostragem deve ser feita de forma minuciosa, amostrando apenas a área que se deseja analisar, tomando cuidado para não contaminar o material.
3. Condições assépticas: As condições mais assépticas possíveis. É imprescindível o uso de luvas descartáveis, material estéril e desinfetantes tópicos, como a clorexidina.
4. Conservação e transporte: As amostras para cultura bacteriológica devem ser mantidas refrigeradas e enviadas ao laboratório o mais rápido possível (máximo 48 horas). Este ponto é essencial, principalmente quando se deseja isolar uma bactéria incômoda como a Glaesserella parasuis,
   cuja viabilidade é afetada por fatores ambientais como temperatura ou tempo de transporte.
5. Identificação da amostra: As amostras devem ser identificadas e armazenadas em recipientes estéreis e herméticos. Embora esse ponto seja bastante direto, muitas vezes falhas são cometidas na identificação das amostras ou as amostras são enviadas sem etiqueta, o que dificulta ao laboratório decidir, por exemplo, qual meio de cultura utilizar para a análise das amostras.

DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

ETAPAS ANTERIORES AO ANTIBIOGRAMA
Assim que a amostra é recebida, o laboratório realiza o diagnóstico em 4 fases:

PROCESSAMENTO E INOCULAÇÃO DA AMOSTRA
A primeira fase consiste no processamento da amostra e inoculação em meios de cultura.

Com auxílio de um cotonete, retira-se a amostra de forma estéril e uma faixa é feita em um meio de cultura adequado para crescimento da bactéria.

GRAM STAIN

PURIFICAÇÃO DA CULTURA
A segunda etapa consiste em obter a cultura pura.

Nesta etapa, o principal interesse é o isolamento de bactérias patogênicas em uma cultura pura.

IDENTIFICAÇÃO
Em seguida, as bactérias são identificadas. Existem diferentes sistemas disponíveis, como a espectrometria de massa (MALDI-TOF Biotyper) que permite uma identificação muito rápida, bastando apenas alguns minutos para identificar uma bactéria. É o método utilizado em hospitais e atualmente vem ganhando espaço nos laboratórios de diagnóstico veterinário.

ANTIBIOGRAMA
A última etapa é a realização do antibiograma.

REALIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA

Para isso, os laboratórios podem utilizar sistemas qualitativos ou quantitativos baseados na determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima).

                  Figura 2. Antibiograma por difusão em ágar (Kirby-Bauer). Leitura dos diâmetros dos halos de inibição.

ENSAIOS QUALITATIVOS 

KIRBY-BAUER

Em relação aos ensaios qualitativos, o sistema mais utilizado é o disco de difusão em ágar ou Kirby-Bauer.

Baseia-se na utilização de discos inoculados com uma concentração específica de um antibiótico e que, uma vez colocados na superfície de uma placa de cultura, se difundem radialmente.

A bactéria em estudo é inoculada em uma placa contendo um meio de cultura sólido específico para o cultivo (por exemplo, ágar Müeller-Hinton).

Os discos com os antibióticos de interesse são dispensados e as placas são incubadas por algumas horas a uma temperatura especificada (geralmente 18-24h a 35-37ºC).

Após a incubação, os diâmetros dos halos de inibição do crescimento que se formam ao redor do antibiótico são mensurados e, a partir da dimensão do diâmetro é possível determinar se a bactéria é sensível ou resistente a este antibiótico.

ENSAIOS QUANTITATIVOS 

Por outro lado, existem diferentes tipos de ensaios quantitativos pelos quais se determina a CIM (expressa em μg / ml ou mg / L), que é a menor concentração de antimicrobiano necessária para inibir o crescimento da bactéria in vitro. As técnicas mais utilizadas são:

MÉTODOS DE DIFUSÃO

E-test: são tiras que contêm uma concentração crescente de antibiótico.

Uma vez depositado em uma placa de cultura com a bactéria de interesse, o antibiótico se difunde criando um gradiente.

Após a incubação, um halo-elipse de inibição é formado onde o valor CIM será o ponto de intersecção do halo com a tira.

Figura 3. Estudo de sensibilidade antimicrobiana com tiras E-teste. Leitura CIM.

MÉTODOS DE DILUIÇÃO

Diluição em ágar sólido: são utilizadas placas com meio de cultura específico e cada uma contém uma concentração de antibiótico.

Adicionando as bactérias, veremos em que concentração a bactéria pode crescer e em que concentração seu crescimento é inibido.

Microdiluição: são utilizadas placas multipoços que contêm vários antibióticos em diferentes concentrações.

A Figura 4 ilustra as etapas a serem seguidas em laboratório. Resumidamente, uma concentração padronizada de bactérias é preparada em um caldo de cultura e adicionada a cada um dos poços (mesmo volume por poço).

As placas são incubadas a uma temperatura e duração específicas e a leitura é realizada posteriormente.

A menor concentração que inibiu o crescimento bacteriano será o CIM.

Este sistema é cada vez mais utilizado devido à existência de sistemas comerciais que permitem automatizar o processo e a leitura dos resultados.

Figura 4. Estudo de susceptibilidade antimicrobiana por microdiluição em placa de 96 poços (12 antibióticos e 8 diluições de antibiótico).

Macrodiluição: é um sistema semelhante ao anterior, a única diferença é que trabalha com volumes maiores.

Figura 5. Diagrama de um estudo de susceptibilidade antimicrobiana por macrodiluição em tubos de ensaio. As concentrações de antibióticos testados variam de 0,03 a 1mg / L. O CIM é igual a 0,5mg / L (primeiro tubo onde o crescimento bacteriano foi inibido).

INTERPRETAÇÃO DE ANTIBIOGRAMAS E CIM

USO DE ANTIBIOGRAMAS NO CAMPO

Uma vez obtidos os valores de CIM ou os diâmetros de inibição, é necessário interpretar os resultados, ou seja, fornecer uma categoria clínica (Sensível / Resistente).

O fato da bactéria isolada ser sensível a um determinado antibiótico significa que, se a infecção for tratada com esse antibiótico com o regime de dosagem registrado, espera-se um curso favorável da infecção.

Em contrapartida, a categoria resistente  significa que o uso desse antibiótico não mudará o curso da infecção. 

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Para atribuir uma categoria clínica, existem alguns documentos produzidos por organizações internacionais (CLSI e EUCAST) que estudam e estabelecem pontos de corte clínicos para que os laboratórios possam interpretar CIMs ou diâmetros.

Esses pontos de corte definem por quantos milímetros de diâmetro a bactéria será considerada sensível a um determinado antibiótico ou a partir de qual CIM a bactéria é resistente a um antibiótico.

Embora na medicina humana os pontos de corte sejam bastante estabelecidos, na medicina veterinária faltam muitos, o que dificulta a interpretação dos resultados em alguns casos.

CONCLUSÕES 

Os antibiogramas são uma ferramenta muito útil para o clínico, pois permitem prever o sucesso / fracasso de um tratamento individual, mas, ao mesmo tempo, permitem monitorar a resistência em uma granja ou pirâmide de produção.

Entretanto, é de grande importância que as informações fornecidas no antibiograma devem ser bem utilizadas. O relatório do laboratório serve como um guia, mas o médico veterinário é responsável por decidir qual terapia antimicrobiana é a mais adequada com base nos resultados laboratoriais, bem como, na sua experiência prévia e, claro, levando em consideração a categorização mais atual dos antibióticos (EMA, relatório AMEG, 2020).

Para concluir, observe que um antibiograma não adianta se vier de um diagnóstico errado. Portanto, vale continuar a enfatizar aos veterinários a importância da coleta de amostras completa e asséptica, apesar das dificuldades que podem ser encontradas em ambientes de granjas pouco estéreis.

Antibiograma: importância da qualidade da amostra e diagnóstico laboratorial