Las técnicas de serotipado de Brachyspira hyodysenteriae basadas en las características del lipopolisacárido de su membrana externa son muy complejas y dan resultados confusos con muchos aislados. Por ello, en la actualidad, se utilizan técnicas moleculares para determinar la variabilidad intraespecífica y estudiar las relaciones epidemiológicas entre diferentes aislados.
La tipificación de las cepas permite comprender mejor la posible relación existente entre las cepas aisladas de diferentes granjas afectadas, las vías de transmisión y las variaciones existentes en zonas geográficas, explotaciones…
Aquilón CyL realiza la tipificación de las cepas de B. hyodysenteriae por la técnica MLVA basada en la amplificación por PCR de múltiples loci de minisatélites llamados VNTR (multiple-locus variable-number tandem-repeat) y que ha sido puesta a punto por el grupo de investigación Digesporc de la Universidad de León.
La determinación del tamaño de una serie de fragmentos de ADN obtenidos por análisis MLVA de dichas cepas se realiza en aislados de B. hyodysenteriae recuperados a partir de heces de cerdos en casos de disentería porcina.
El tamaño de cada uno de estos loci puede ser determinado mediante electroforesis.
El número de repeticiones existente en cada uno de los locus es un parámetro que define a una cepa.
Cuando al comparar dos aislados, este número de repeticiones es el mismo en todos los loci estudiados, ambas cepas son incluidas en un mismo complejo clonal, asumiendo que están muy próximas genéticamente y que probablemente son idénticas.
Por el contrario, si el número de repeticiones es diferente en varios de los loci, indicará que estas cepas son diferentes.
Para la tipificación de las cepas de B. hyodysenteriae se amplifican 8 loci polimórficos diferentes de manera independiente, empleando para cada uno de ellos un par de cebadores mediante PCR convencional.
Los loci se denominan 6, 7, 10, 12, 17, 21, 22 y 23. Los loci 6, 10, 21 y 22 codifican, presumiblemente, proteínas mientras que los cuatro restantes se ubican en regiones intergénicas.
Los datos obtenidos mediante MLVA permiten confeccionar mapas en los que se sitúen los brotes de disentería y la relación entre las cepas recuperadas en cada uno de ellos, ofreciendo una visión global de un área geográfica que se puede ir actualizando a medida que aparezcan nuevos focos confirmados de disentería porcina.
Desde el 2016 y hasta la actualidad hemos estudiado, empleando esta técnica, la epidemiología de la disentería porcina en un área de alta densidad de producción (superior a 200 cerdos/km2) en la que existen numerosas granjas de muy diverso tipo, fábricas de pienso, mataderos, etc.
Hasta el momento, hemos identificado en esta zona geográfica 17 tipos MLVA distintos en aislados de Brachyspira hyodysenteriae, lo que muestra la variabilidad genética de esta especie bacteriana.
El tipo de MLVA predominante en la zona estudiada es el identificado como tipo 2; de hecho, en 8 de las 13 empresas que operan en la zona se ha aislado este tipo que representa el 70,7 % del total de los aislados analizados.
Esta evidencia demuestra la transmisión entre empresas que operan en granjas situadas en la misma zona geográfica.
Además, como se observa en la Figura 2,existió un tipo clonal, tipo 3, que se detectó únicamente en granjas de una misma empresa, lo que indica la transmisión de la disentería porcina entre granjas diferentes pertenecientes a una empresa.
Cabe destacar, también, la detección de dos aislados anómalos en una misma empresa y granja, tipificados como MLVA 17. Se trata de una granja de abuelas en la que no se observa un cuadro clínico claro de disentería porcina, ya que muy pocas cerdas presentaban un cuadro clínico de blandeo en las heces.
¿Para qué sirve la tipificación de una cepa de B. hyodysenteriae?
Epidemiología
La información que arroja la tipificación de la cepa que ocasiona un brote de disentería es relevante, máxime en zonas de alta densidad en las que la presión de transmisión y/o infección es alta, coexistiendo diversas explotaciones porcinas, mataderos y fábricas de piensos así como continuos movimientos del ganado.
La técnica de MLVA nos permite comparar la cepa de un brote que se desarrolla en una granja con las cepas aisladas en la misma zona geográfica y/o en granjas de madres y estudiar el posible origen de la infección.
Transmisión
Otro ejemplo claro de la utilidad de las herramientas moleculares para la identificación de la ruta de transmisión de la disentería porcina es el siguiente caso al que nos enfrentamos.
Se trata de dos granjas situadas a más de 300 km de distancia.
Granja A
La granja A es una explotación de genética para la producción de abuelas, libre de disentería y con un elevado estado sanitario mientras que la granja B es de nueva construcción con cerdas y naves nuevas, destinada a la producción de primerizas y con elevadas medidas de bioseguridad.
Granja B
La granja B recibió un lote de abuelas de la granja A. Transcurrido un mes tras su llegada a las instalaciones de la granja B se producen los primeros casos de disentería.
La pregunta es obvia, ¿cómo es posible que se desarrolle un brote si las cerditas provienen de una granja libre de disentería?
Se analizaron todos los posibles vectores y vehículos que podrían haber facilitado su transmisión y se concluyó que el camión empleado para el transporte de las abuelas era el responsable de la transmisión.
Se comprobó que el camión había transportado cerdos de cebo afectados de disentería de una granja diferente, granja X, un jueves.
Tras el transporte, el camión se limpió y desinfectó y no se volvió a utilizar hasta el lunes siguiente, cuando transportó a las abuelas primerizas de la granja A a la granja B.
El análisis molecular permitió demostrar que el perfil MLVA de las cepas aisladas en la granja B coincidía al 100 % con los aislados procedentes de la granja X.
El camión actuó en la transmisión indirecta de la disentería porcina originando la contaminación en una granja nueva y constituida con cerdas libres de B. hyodysenteriae.
La supervivencia ambiental de B. hyodysenteriae junto con los protocolos de limpieza y desinfección insuficientes facilitaron esta transmisión demostrando que los camiones pueden ser una importante fuente de infección ya que pueden permanecer restos de heces en los rincones de difícil acceso impidiendo la acción de los desinfectantes sobre B. hyodysenteriae.
Estos dos ejemplos demuestran la importancia de la tipificación de las cepas mediante MLVA como herramienta epidemiológica relativamente sencilla y de bajo coste para la monitorización de las rutas de transmisión y/o vías de infección de B. hyodysenteriae.
Cuando al comparar dos aislados, este número de repeticiones es el mismo en todos los loci estudiados, ambas cepas son incluidas en un mismo complejo clonal, asumiendo que están muy próximas genéticamente y que probablemente son idénticas.
Los datos obtenidos mediante MLVA permiten confeccionar mapas en los que se sitúen los brotes de disentería y la relación entre las cepas recuperadas en cada uno de ellos, ofreciendo una visión global de un área geográfica que se puede ir actualizando a medida que aparezcan nuevos focos confirmados de disentería porcina.
Hasta el momento, hemos identificado en esta zona geográfica 17 tipos MLVA distintos en aislados de Brachyspira hyodysenteriae, lo que muestra la variabilidad genética de esta especie bacteriana.
Granja B
Se comprobó que el camión había transportado cerdos de cebo afectados de disentería de una granja diferente, granja X, un jueves.
Tras el transporte, el camión se limpió y desinfectó y no se volvió a utilizar hasta el lunes siguiente, cuando transportó a las abuelas primerizas de la granja A a la granja B.
El análisis molecular permitió demostrar que el perfil MLVA de las cepas aisladas en la granja B coincidía al 100 % con los aislados procedentes de la granja X.
