Los coronavirus entéricos porcinos incluyen algunos de los patógenos virales más relevantes para el sector porcino, como el virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP) o el virus de la gastroenteritis transmisible porcina (VGET), así como algunos otros virus recientemente identificados como el coronavirus entérico porcino (SeCoV), el deltacoronavirus porcino (PDCoV) o el alfacoronavirus entérico porcino (SeACoV).
El objetivo de este estudio fue la identificación y caracterización de los coronavirus que causan brotes entéricos en las explotaciones porcinas españolas y los resultados demostraron que el VDEP es patógeno relevante en España, confirmando también que ninguno de los nuevos coronavirus emergentes está circulando de forma significativa en nuestro país.
Dado que las características clínicas y lesionales de los brotes causados por diferentes virus entéricos son indistinguibles, la puesta a punto de herramientas diagnósticas y la vigilancia activa es fundamental para conocer la incidencia y evolución temporal de estos virus y para poder frenar su propagación en caso de aparición.
INTRODUCCIÓN A LOS CORONAVIRUSPORCINOS
Los coronavirus (CoV) infectan a una gran variedad de animales, tanto mamíferos como aves, ocasionando procesos respiratorios, entéricos e incluso hepáticos y neurológicos1. Pertenecen a la familia Coronaviridae, en la que se reconocen cuatro géneros basados en su agrupación filogenética: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus y Deltacoronavirus.
Los CoVs son virus con envoltura y su genoma está compuesto por un ARN no segmentado, monocatenario y de polaridad positiva con un tamaño de ∼30 kb, el más grande entre todos los virus ARN.
Desde el extremo 5′ hasta el extremo 3′, su genoma incluye, al menos, seis marcos de lectura abiertos (ORF):
Algunos CoVs codifican alguna otra proteína no estructural de función no claramente establecida.
El primer coronavirus identificado en el ganado porcino fue el virus de la gastroenteritis transmisible (VGET). Sin embargo, actualmente, la relevancia de este virus es limitada debido a la amplia distribución de un mutante respiratorio del VGET, el coronavirus respiratorio porcino (CVRP), que protege parcialmente a los animales frente a la enfermedad entérica.
El virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP) fue descrito por primera vez en Europa y Asia durante los años setenta y ochenta, respectivamente3.
En Europa su incidencia disminuyó notablemente a partir de los años noventa, mientras que en Asia se ha mantenido como una de las principales causas de brotes de diarrea desde su aparición y hasta la actualidad.
En 2010 se describieron en China nuevas variantes altamente patógenas del VDEP, que se extendieron rápidamente a otros países de la región.
En América, el VDEP emergió en abril de 2013, extendiéndose de forma rápida por EE.UU. y otros países como Canadá, México o Colombia y causando importantes pérdidas económicas4.
El VDEP también reapareció en Europa poco después de su primera descripción en los EE.UU., habiéndose notificado brotes de VDEP en varios países europeos desde 20145-7.
Se han descrito dos genogrupos principales del VDEP, denominados INDEL o G1 y no INDEL o G2, que se diferencian por inserciones-deleciones en la subunidad S1 del gen S8,9.
LOS AISLADOS NO INDEL DE VDEP SE HAN ASOCIADO CON UNA MAYOR VIRULENCIA Y UNA MEJOR TRANSMISIÓN HORIZONTAL10
Ambos genogrupos han sido identificados en granjas infectadas de Asia y América, mientras que en Europa no hay pruebas de la presencia del genogrupo G2 o no-INDEL, con la única excepción de un aislado detectado en una explotación porcina de Ucrania en 201411.
CORONAVIRUS PORCINOS EMERGENTES
En los últimos años se han descubierto nuevos coronavirus que afectan a los cerdos causando un cuadro clínico entérico indiferenciable del causado por el VGET y el VDEP.
Se ha identificado un virus quimérico producido por la recombinación del VGET o su mutante respiratorio CVRP (secuencia principal) con el VDEP (que aporta el gen S) (Figura 1), denominado coronavirus entérico porcino (SeCoV), en varios países europeos, entre ellos España12-15.
Además, en 2012, se describió un deltacoronavirus porcino (PDCoV) en Hong Kong16, detectándose posteriormente en explotaciones porcinas de EEUU, Canadá y de varios países asiáticos17.
Finalmente, [registrados]se ha descrito un nuevo alfacoronavirus porcino, denominado alfacoronavirus entérico porcino (SeACoV) o también coronavirus del síndrome de diarrea aguda porcina (SADS-CoV) como agente etiológico de brotes de diarrea grave en lechones neonatos en China18-22.
La aparición de estos nuevos CoVs y la reaparición del VDEP en Europa hace necesario realizar estudios que permitan determinar el impacto de estos virus en las explotaciones porcinas de nuestro ámbito.
Nuestro trabajo pretende conocer la prevalencia de los diferentes CoVs entéricos en España a través del estudio de brotes de diarrea en granjas porcinas españolas entre 2017 y 2019.
PREVALENCIA DE CORONAVIRUS ENTÉRICOS PORCINOSEN ESPAÑA
MATERIAL Y MÉTODOS
RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El estudio se realizó entre enero de 2017 y marzo de 2019 en 106 explotaciones porcinas con brotes de diarrea en los que se sospechaba una etiología viral distribuida por 22 provincias de la mitad norte de España (Figura 2).
Los brotes afectaron a lechones lactantes (<21 días) (28 explotaciones), cerdos de transición o precebo (21-70 días) (17 explotaciones) o cerdos de engorde (>70 días) (61 explotaciones) y, en todos los casos, se remitieron muestras de heces para su diagnóstico a la Unidad de Enfermedades Infecciosas del Departamento de Sanidad Animal de la Universidad de León. De cada granja se enviaron entre dos y seis muestras individuales que se unieron para preparar una única muestra o mezcla por granja.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS CORONAVIRUS ENTÉRICOS PORCINOS
Se llevaron a cabo dos RT-PCR dúplex para la detección de SeACoV (ORF1ab), VGET/SeCoV (gen N), VDEP/SeCoV (gen S) y PDCoV (gen N) (Tabla 1). También se realizaron dos RT-PCR convencionales para confi rmar el SeCoV, excluyendo una posible coinfección VDEP-VGET, mediante la detección del gen M del VDEP y del gen S del VGET.
SECUENCIACIÓN DEL GEN S DEL VDEP
En todas las muestras positivas a VDEP se secuenció el gen S amplificando cuatro fragmentos superpuestos (Verso 1-Step RT-PCR ReddyMix, Thermo Scientific). Las secuencias completas del gen S obtenidas pueden consultarse en la plataforma GenBank con los números de acceso MW251343 a MW251378 (Tabla 2).
Adicionalmente, en cinco aislados obtuvimos la secuencia completa del genoma viral utilizando un protocolo de secuenciación de nueva generación específico para virus ARN desarrollado por investigadores de la Universidad Autónoma de Barcelona15.
RESULTADOS
PREVALENCIA DE CORONAVIRUS ENTÉRICOS EN LOS BROTES DE DIARREA PORCINA
No se detectó el VGET, el SeCoV, el PDCoV ni el SeACoV en ninguna de las muestras, siendo el VDEP el único coronavirus detectado en 41 de los 106 brotes investigados (38,7 %).
A pesar de que no se observaron diferencias significativas en el número de brotes confirmados en función de la edad de los animales afectados, podemos destacar que la mayoría de los brotes se produjeron en cerdos en crecimiento o transición (9 explotaciones positivas de 17, 52,9 %) seguidos por los cerdos de engorde (24 explotaciones positivas de 61, 39,3 %).
El VDEP estuvo implicado en menor medida en los brotes de diarrea que afectaron a los lechones lactantes (8 granjas positivas de 28, 28,6 %).
Se detectaron explotaciones positivas al VDEP en todo el área muestreada, con al menos un brote positivo en 10 de las 22 provincias incluidas en el estudio (Figura 2). No se observaron diferencias significativas en el número de brotes confirmados de VDEP entre provincias (p=0,286).
En lo que respecta a la distribución temporal, la mayoría de los brotes ocurrieron durante el primer trimestre del año (p=0,041) (Figura 3), en los meses más fríos. La detección del VDEP también fue más frecuente durante los tres primeros meses del año, aunque sin alcanzar diferencias significativas (p=0,097).
ANÁLISIS FILOGENÉTICO BASADO EN LAS SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS DEL GEN S DEL VDEP
Las secuencias completas del gen S de todas las muestras positivas del VDEP41 se compararon con las secuencias disponibles del VDEP y del SeCoV (Figura 4).
El árbol filogenético mostró que todos los aislados del VDEP recuperados en España entre 2017-2019 corresponden al genogrupo INDEL 2 o G1b, agrupándose con aislados europeos recientes de este coronavirus y con algunos aislados recientes de EE.UU. y Asia, claramente separados de los aislados del genogrupo G2 o no INDEL o G2, así como de los aislados originales de VDEP europeos o asiáticos incluidos en el genogrupo INDEL 1 o G1a.
Se identificaron tres subgrupos o clústers a partir de los aislados españoles de VDEP que hemos identificado como INDEL 2.1, 2.2 y 2.3 (Figuras 4 y 5).
El primero de estos subgrupos incluyó dos aislados españoles recuperados en 2018 y 2019 junto con otros aislados del VDEP españoles y europeos recuperados entre 2014 a 2016.
El clúster INDEL 2.2 incluyó aislados españoles de 2014 a 2019, todos ellos próximos geográficamente (misma región) y recuperados de explotaciones pertenecientes a una única empresa productora, junto con cepas asiáticas y americanas del VDEP del mismo periodo de tiempo.
DISCUSIÓN
La identificación reciente de nuevos coronavirus porcinos, como el PDCoV o el SeACoV, junto con la emergencia y reemergencia del VDEP han renovado el interés por estos virus entéricos que se asocian a diarreas agudas y de alta morbilidad en cerdos de todas las edades, así como a elevada mortalidad en neonatos en las explotaciones sin inmunidad.
LAS ENFERMEDADES ENTÉRICAS CAUSADAS POR ESTOS CoVs SON CLÍNICAMENTE INDISTINGUIBLES, POR LO QUE EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL EN EL LABORATORIO ES UNA HERRAMIENTA ESENCIAL
En el presente estudio se investigaron 106 brotes de diarrea con sospecha viral, ocurridos entre 2017 y 2019, siendo el VDEP el único CoV entérico detectado en las granjas porcinas españolas. Se identificó en cerca del 40% de los brotes investigados, confirmando su reemergencia de forma similar a lo descrito en varios países europeos26.
La distribución temporal de la enfermedad fue estacional y la mayoría de los brotes entéricos asociados al VDEP se produjeron en los meses de invierno, cuando las bajas temperaturas favorecen la supervivencia del virus en el ambiente y facilitan su transmisión indirecta3,27.
La mayoría de los brotes se observaron en la fase de transición o en el engorde.
La menor prevalencia del VDEP en los brotes entéricos que afectan a lechones podría ser explicada por la presencia de inmunidad maternal que protegería a los lechones en las primeras semanas de vida, o por un nivel más elevado de bioseguridad en las instalaciones de partos.
La pérdida de los anticuerpos maternales, unida a la mezcla de lechones tras el destete, podría explicar el mayor porcentaje de brotes positivos en los cerdos posdestete1.
Nuestro estudio es el primero en investigar activamente sobre los nuevos coronavirus entéricos como el PDCoV o el SeACoV en explotaciones porcinas de Europa.
Mientras que el SeACoV tiene una distribución geográfica limitada y solo se ha detectado en explotaciones porcinas de China18,19, el PDCoV se ha notificado en Estados Unidos, Corea del Sur, Tailandia y China28. Los estudios filogenéticos sugieren que el PDCoV identificado en Corea del Sur fue introducido desde EE.UU.28, hecho que probaría su capacidad para propagarse internacionalmente.
Nuestros resultados indican que, con gran probabilidad, ninguno de estos dos CoVs emergentes están presentes en la población porcina.
Dada la capacidad demostrada por estos virus para propagarse y emerger, junto a la probable falta de inmunidad previa de la población porcina europea, es fundamental implementar programas de monitorización que permitan una rápida detección y alerta que limiten su propagación entre países o continentes.
Finalmente, el análisis filogenético de las secuencias completas del gen S de todos los aislados del VDEP identificados demostró que, al igual que en otros países europeos5-7,27, todos los aislados del VDEP recuperados entre 2017 y 2019 correspondieron al genogrupo G1b o INDEL 2.
Se ha demostrado que este genogrupo causa una enfermedad menos grave y menos transmisible que el genogrupo G2 o INDEL3,8, hecho que podría explicar el limitado impacto económico de la reemergencia del VDEP en Europa en comparación con sus dramáticas consecuencias en Estados Unidos o en Asia29.
Además, este análisis permitió identificar tres subgrupos de aislados, con ciertas relaciones geográficas siendo destacable que el subgrupo más frecuente y de distribución más amplia fue el identificado como clúster 2.3, descrito recientemente en diferentes países europeos14,15,24 y señalado como el más común en algunos estudios recientes30.
Estos aislados se caracterizan por presentar un fragmento recombinante de aproximadamente 400 nucleótidos en el extremo 5′ del gen S, siendo el VDEP y el SeCoV los progenitores mayor y menor, respectivamente. Dado que la proteína S del VDEP es una diana clave para los anticuerpos neutralizantes se ha propuesto que este evento de recombinación podría proporcionar algunas ventajas30,31 y explicar la amplia distribución de esta variante viral.
CONCLUSIONES
Este trabajo confirma que el VDEP es una causa relevante de procesos entéricos en España, detectándose en casi el 40 % de los brotes de diarrea con sospecha de etiología viral entre 2017 y 2019. Sin embargo, dado que la mayoría de los brotes se producen en cerdos de transición o de engorde, el impacto clínico y económico de esta infección es limitado.
Tan solo se detecta circulación de aislados del VDEP del genogrupo G1b o INDEL 2. Además, la variante que incluye un fragmento recombinante en el gen S correspondiente al SeCoV es la más ampliamente distribuida.
No hemos detectado otros coronavirus entéricos como el VGET, SeCoV, PDCoV o SeACoV en los brotes de diarrea investigados. Sin embargo, la elevada capacidad de propagación de estos virus, unida a la posibilidad de eventos de mutación o recombinación, hace necesario mantener una vigilancia que permita detectar la posible aparición de alguno de estos CoVs o de nuevas variantes del VDEP.
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En Europa su incidencia disminuyó notablemente a partir de los años noventa, mientras que en Asia se ha mantenido como una de las principales causas de brotes de diarrea desde su aparición y hasta la actualidad.
El primero de estos subgrupos incluyó dos aislados españoles recuperados en 2018 y 2019 junto con otros aislados del VDEP españoles y europeos recuperados entre 2014 a 2016.
El clúster INDEL 2.2 incluyó aislados españoles de 2014 a 2019, todos ellos próximos geográficamente (misma región) y recuperados de explotaciones pertenecientes a una única empresa productora, junto con cepas asiáticas y americanas del VDEP del mismo periodo de tiempo.
