El virus de la Influenza A (IAV) y el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV) son considerados patógenos clave involucrados en el Complejo Respiratorio Porcino. El efecto de un virus sobre otro en lo que respecta a la respuesta inmunitaria local es aún muy limitado y la determinación de la presencia y la cantidad de citoquinas en el tejido pulmonar, así como su relación con la patología pulmonar, puede conducir a una mejor comprensión de la respuesta inflamatoria del hospedador y su influencia en la patología pulmonar durante la infección con uno o varios virus. El objetivo del presente estudio fue explorar y comparar los patrones de respuesta de citoquinas pulmonares en cerdos tras una infección única o mixta con IAV y/o PRRSV.
ALTERACIONES INFLAMATORIAS ASOCIADASAL IAV Y AL PRRSV
El Complejo Respiratorio Porcino (CRP) es un grave problema sanitario para la producción porcina mundial1,2, estando implicados en este síndrome varias combinaciones de agentes virales y/o bacterianos. Entre ellos, el virus de la Influenza A (IAV) y el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV) se consideran patógenos virales cruciales implicados en el CRP3-5.
El PRRSV es el agente causal del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino6, siendo características típicas de la infección por este virus la supresión de la producción de interferón tipo I y la modulación de la respuesta inmunitaria del hospedador7.
El virus de la Influenza A es el agente etiológico de la Influenza porcina, una enfermedad caracterizada por una baja mortalidad (1-2%) y una alta morbilidad (hasta el 100%)8. El aumento de la producción de muchas citoquinas proinflamatorias, fenómeno conocido como “tormenta de citoquinas”, es típica en la gripe aguda en humanos9-11 y se considera de gran importancia en la patogénesis de la gripe porcina12-14.
Anteriormente, se han publicado algunos estudios relativos a la infección simultánea de cerdos con diversos virus respiratorios, incluidos IAV y PRRSV15-18. Hasta ahora, los estudios experimentales sobre infecciones simples o mixtas con PRRSV e IAV se han centrado en las manifestaciones clínicas y en el rendimiento productivo, obteniéndose resultados clínicos muy diversos en el caso de las coinfecciones16-18.
Independientemente de los resultados de los estudios previos de coinfección, nuestra comprensión del efecto de un virus sobre otro con respecto a la respuesta inmunitaria local sigue estando muy limitada.
EL PAPEL DE LAS CITOQUINAS PROINFLAMATORIASEN LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS
Las citoquinas proinflamatorias desempeñan un papel importante en las infecciones respiratorias porcinas al coordinar y activar la respuesta inmunitaria adaptativa19,20. Sin embargo, si el nivel de citoquinas es excesivo, puede producirse daño tisular y exacerbación de la enfermedad21.
La determinación de la presencia y la cantidad de citoquinas en el tejido pulmonar y su relación con la patología pulmonar puede mejorar la comprensión de la respuesta inflamatoria del hospedador durante la infección por uno o varios virus.
En un estudio in vitro se investigó el impacto de las coinfecciones de PRRSV y virus de la influenza porcina (SIV, por sus siglas en inglés, swine influenza virus) en varios genes (receptores de reconocimiento de patógenos, interferones tipo I, citoquinas y genes inducibles por IFN) y proteínas, demostrándose efectos en la respuesta inmunitaria celular y tisular a nivel molecular22.
Otro estudio in vivo sobre la respuesta inmunitaria innata local en las células del líquido de lavado broncoalveolar (BAL) de cerdos inoculados individualmente con PRRSV o coinoculados con PRRSV e IAV, reveló que la infección con PRRSV solo o con IAV afectaba a la expresión de IFN-α y retrasaba el inicio de la expresión de IFN-γ. Además, la coinfección con ambos virus demostró tener efectos aditivos sobre la expresión del ARNm de IL-6 y IL-1023.
DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE CITOQUINAS EN LA INFECCIÓN SIMPLE O MIXTADE IAV Y/O PRRSV
El objetivo del presente estudio fue determinar los patrones de respuesta de las citoquinas pulmonares en los cerdos tras la infección simple o mixta con IAV y/o PRRSV.
MATERIAL Y MÉTODOS
ANIMALES E INFECCIÓN CON CEPAS DE PRRSV Y/O IAV
El estudio se realizó [registrados]con 56 lechones de 7 semanas de vida, libres de IAV y PRRSV (seronegativos y no vacunados frente a estos patógenos), además de ser seronegativos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky y Mycoplasma hyopneumoniae. Los exámenes clínicos, serológicos y anatomopatológicos no revelaron ningún indicio de estreptococias ni de rinitis atrófica.
Los lechones se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos experimentales (14 lechones/ grupo):
Grupo PRRSV
Grupo IAV + PRRSV
Grupo IAV
Grupo CONTROL
SE INOCULÓ A LOS LECHONES POR VÍA INTRANASAL CON IAV (SWH1N1) Y/O PRRSV (CEPA PL15-33, SUBTIPO 1 DEL PRRSV)
El día 0, los lechones de los grupos IAV e IAV + PRRSV fueron inoculados por vía intranasal con SwH1N1 (107 TCID50) en 2 ml de PBS.
Los lechones de los grupos PRRSV e IAV + PRRSV fueron inoculados por vía intranasal con PRRSV (105 TCID50) en 2 ml de PBS.
Los lechones inoculados con PBS sirvieron de control.
MONITORIZACIÓN DE SIGNOS CLÍNICOS
Los lechones fueron sometidos a un examen clínico diario y a la medición de la temperatura rectal (desde el día 7 preinoculación hasta el día 21 postinoculación (dpi) o hasta la eutanasia (a los 2, 4 y 10 dpi).
La severidad de las lesiones clínicas se evaluó basándose en un sistema de puntuación adaptado al PRRS y a la Influenza Porcina24. Los parámetros de bienestar, respiración, trastornos oculares, temperatura rectal y apetito se puntuaron de 0 (estado normal) a 1 (los trastornos más graves de cada categoría).
Las puntuaciones de los cerdos individuales en cada categoría se sumaron para obtener una puntuación clínica acumulada (CS) por animal.
EVALUACIÓN DE LESIONES PULMONARES
Con el fin de evaluar los patrones de lesiones asociados a las infecciones en los distintos grupos evaluados, se sacrificaron a los lechones a los 2, 4, 10 y 21 dpi, realizándose la necropsia completa de cada animal, con especial atención al tracto respiratorio.
Las lesiones pulmonares macroscópicas se puntuaron según el método descrito por Halbur et al.39 y adaptado por Pomorska-Mól et al.24.
A cada lóbulo pulmonar se le asignó un número para reflejar el porcentaje aproximado del volumen de todo el pulmón representado para alcanzar el total de 100 puntos posibles.
La evaluación según el procedimiento mencionado dio una puntuación pulmonar (LS) que permite estimar el porcentaje del pulmón afectado por neumonía.
CONCENTRACIÓN DE CITOQUINAS LOCALES
El tejido pulmonar recogido de lechones durante la necropsia se preparó en PBS (pH 7,4)8,24. 1,0 g de tejido pulmonar recogido de los lóbulos craneal, medio y accesorio derecho (3,0 g en total) se suspendieron en 3 ml de PBS (1:1 p/v) y se congelaron antes de ser homogeneizados. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -80°C hasta un máximo de 1 mes.
Posteriormente, se analizaron las concentraciones de las siguientes citoquinas mediante kits ELISA:
IL-8
IL-10
IFN-α
TNF-α
IL-1β
IFN-γ
IL-6
RESULTADOS
RESUPUESTA LOCAL DE CITOQUINAS
En general, las concentraciones pulmonares de las citoquinas estudiadas se vieron afectadas en los lechones inoculados (IAV o PRRSV) y coinoculados (IAV + PRRSV).
En los lechones inoculados únicamente con PRRSV se observó un nivel significativamente mayor de IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-10, TNF-α e IL-8 en varios momentos después de la inoculación.
En los lechones inoculados únicamente con IAV, las concentraciones de IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 en el pulmón fueron elevadas (p < 0,05), sobre todo en las primeras etapas tras la inoculación (2 a 4 dpi).
En los lechones coinoculados (IAV + PRRSV) se encontraron niveles elevados de todas las citoquinas estudiadas en comparación con los lechones control.
Interferones
IFN-α
La concentración de IFN-α se elevó principalmente en la fase inicial de las infecciones experimentales (2 y 4 dpi).
Los niveles más altos de esta citoquina en los pulmones se observaron a los 2 dpi en los lechones inoculados con PRRSV o coinoculados con IAV y PRRSV.
A los 4 dpi, la concentración de IFN-α fue significativamente mayor en todos los grupos inoculados en comparación con el grupo control.
En el grupo coinoculado (IAV + PRRSV) también se observó un incremento significativo de IFN-α a los 10 dpi.
IFN-γ
En los lechones inoculados con IAV no se observaron cambios en los niveles de IFN-γ salvo a los 2 dpi.
A partir de los 10 dpi se observó un ligero incremento en la concentración de IFN-γ en los lechones inoculados o coinoculados con PRRSV.
Las concentraciones medias de esta citoquina fueron particularmente altas a los 10 dpi en los grupos PRRSV y IAV + PRRSV. A los 4 dpi, la concentración media de IFN-γ fue similar a la observada en los lechones control.
Interleuquinas
IL-1β
Se observó una concentración significativamente mayor de IL-1β en los lechones coinoculados (a los 4, 10 y 21 dpi), mientras que en los lechones inoculados únicamente con PRRSV solo se observó este incremento a los 10 dpi.
IL-6
La concentración media de IL-6 fue elevada en los lechones inoculados y coinoculados con IAV a los 2 dpi. En cambio, a los 10 dpi se encontraron concentraciones elevadas de IL-6 en los lechones inoculados y coinoculados con PRRSV. A los 4 y 21 dpi no se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo de control.
IL-10
A los 2 dpi, el nivel de IL-10 fue mayor en los animales inoculados o coinoculados con IAV. También se observaron diferencias significativas a los 4 dpi entre el grupo IAV y el grupo control. A los 10 dpi, el nivel de esta citoquina fue máximo en los lechones coinoculados (IAV + PRRSV), siendo significativamente mayor en todos los grupos inoculados en comparación con los lechones control. A los 21 dpi, las concentraciones medias de IL-10 fueron significativamente mayores en el grupo IAV + PRRSV en comparación con los lechones control.
Superfamilia TNF
Se observaron cambios significativos en los niveles de TNF-α a los 4 dpi en el grupo IAV, a los 10 dpi en los grupos PRRSV e IAV + PRRSV y a los 21 dpi en el grupo IAV + PRRSV.
Quimioquinas
En todos los animales inoculados se observó una concentración significativamente mayor de IL-8, en comparación con los controles a los 2 y 10 dpi, mientras que a los 21 dpi este aumento solo fue significativo en los animales inoculados/coinoculados con PRRSV. Además, a los 2, 4 y 10 dpi el nivel de IL-8 en los pulmones fue significativamente mayor en los grupos inoculado y coinoculado con PRRSV en comparación con el grupo inoculado solamente con IAV.
Al analizar la correlación entre la carga de patógenos en el pulmón y la concentración de citoquinas se observó una asociación significativa entre la concentración pulmonar media de TNF-α, IFN-γ e IL-8 y el título de SwH1N1 en el pulmón.
También se encontraron correlaciones significativas para el TNF-α y la IL-8 y el título pulmonar del PRRSV, para los grupos coinoculados (IAV + PRRSV) e inoculados con un patógeno (IAV o PRRSV).
DISCUSIÓN YCONCLUSIONES
En este artículo se han descrito los efectos de la inoculación única o mixta de lechones con IAV y PRRSV en la respuesta local de citoquinas a nivel pulmonar durante el curso de la infección con estos patógenos.
Datos publicados anteriormente revelan que los signos respiratorios asociados a la infección por IAV no son solo el resultado del daño tisular directo causado por la replicación del virus, sino que también están relacionados con la respuesta proinflamatoria de citoquinas locales14,26,27.
Por su parte, los signos respiratorios observados durante la infección por PRRSV también son el resultado de la patología en el pulmón y de la interacción con el sistema inmunitario del hospedador, incluida la secreción de citoquinas proinflamatorias21. Además, el PRRSV predispone a los cerdos a la coinfección con otros virus respiratorios debido a la destrucción de los tejidos o células pulmonares6,28.
Las citoquinas desempeñan un papel importante en la inmunopatogenia de las infecciones respiratorias víricas porcinas14,18,21,23,25,29,30 de forma que, cuando el hospedador está infectado por varios virus, la secreción de citoquinas se regula al alza o a la baja26. De hecho, las concentraciones de citoquinas en el líquido de lavado broncoalveolar se han correlacionado con la replicación viral y los signos clínicos, así como con las lesiones pulmonares exacerbadas y la infiltración de neutrófilos18,26.
Generalmente, la magnitud de las lesiones patológicas no se correlaciona positivamente con el número de partículas víricas en los tejidos infectados, sino que puede ser el resultado de una lesión asociada a la respuesta inmunitaria, incluida la secreción de citoquinas21,31.
En este estudio, las concentraciones de las citoquinas evaluadas fueron elevadas en los pulmones de los lechones inoculados con IAV, PRRSV o con ambos en comparación con los controles. Las concentraciones más altas de citoquinas se observaron en varios momentos dependiendo del virus inoculado.
IL-1β e IL-8
En estudios anteriores sobre la inmunopatogénesis de la infección por el IAV se ha observado una correlación positiva entre un nivel elevado de IL-1β y el reclutamiento de neutrófilos en los pulmones, lo que puede conducir a una inflamación más grave30,32. La elevada concentración de IL-8 también puede contribuir a que las lesiones sean más graves14.
TNF-α
Según Damjanovic et al.33, el TNF-α es necesario para regular el alcance de la afectación pulmonar durante la infección aguda por influenza.
En este sentido, la correlación entre los niveles de esta citoquina y la afectación pulmonar podría confirmar su implicación en el desarrollo de las lesiones pulmonares durante las infecciones víricas.
IL-6
Se encontraron concentraciones significativamente más altas de IL-6 en los pulmones de los lechones inoculados con IAV en las primeras etapas de la infección (a los 2 dpi). En cambio, en los lechones inoculados o coinoculados con PRRSV también se observó un nivel elevado de IL-6 a los 10 dpi.
Lauder et al.34 señalaron que la IL-6 tiene un papel crucial y la capacidad de limitar la inflamación, promover la inmunidad adaptativa protectora y prevenir la mortalidad.
LA SECRECIÓN TEMPRANA DE IL-6 PODRÍA CONSTITUIR UNA IMPORTANTE DEFENSA FRENTE A LA INFLUENZA PORCINA Y, POSIBLEMENTE, OTRAS INFECCIONES RESPIRATORIAS VÍRICAS
IL-10
El papel de la IL-10 durante la infección respiratoria, especialmente la influenza aguda, parece ser contradictorio. Sun et al.35 descubrieron que la inhibición de la secreción de IL-10 en la infección por influenza provocaba un aumento de la inflamación y una disminución de la supervivencia, mientras que McKinstry et al.36 señalaron que la inhibición de la señalización de IL-10 antes de la infección mejoraba la eliminación del virus y aumentaba la supervivencia.
La fuerte correlación positiva entre el nivel de IL-10 en los pulmones y las lesiones observadas en el presente estudio parecen confirmar las observaciones de Sun et al.35.
La concentración de IL-10 en los lechones inoculados y coinoculados con PRRSV fue significativamente elevada a los 10 y 21 dpi.
En concordancia con nuestro estudio, varios estudios anteriores habían demostrado que la infección por PRRSV, especialmente en la fase activa, resultaba en la producción sistémica y local de la citoquina inmunosupresora IL-1037,38.
CORRELACIÓN CITOQUINAS – LESIONES PULMONARES
En general, el perfil de cambios en los niveles de citoquinas pulmonares en este estudio refleja la patogénesis de ambas infecciones. La presencia de lesiones pulmonares típicas de la infección por IAV se observó antes, principalmente hasta los 10 dpi, mientras que las lesiones típicas de la infección por PRRSV se encontraron más tarde, a partir de los 10 dpi.
En el grupo inoculado únicamente con IAV, los niveles más altos de citoquinas se observaron en las primeras fases de la infección (2-4 dpi) en correspondencia con las lesiones pulmonares patológicas más graves.
En el grupo inoculado únicamente con PRRSV, los cambios de citoquinas más pronunciados también se asociaron con el periodo en el que la gravedad de las lesiones pulmonares era mayor (de 10 a 21 dpi).
Cabe resaltar que no se observaron efectos sinérgicos entre IAV y PRRSV en cuanto a la respuesta local de citoquinas. Esto puede estar asociado a la diferente patogénesis de ambas infecciones, especialmente en el contexto del momento de aparición de las lesiones en los pulmones.
En el caso de la influenza porcina, las lesiones pulmonares aparecen y desaparecen antes, mientras que en el caso del PRRS la intensidad de las lesiones pulmonares es mayor durante el periodo en el que desaparecen las lesiones asociadas a la influenza.
En conclusión, los resultados actuales indican que la infección experimental de cerdos con IAV o PRRSV, solos o en coinfección, induce una respuesta inflamatoria pulmonar local. Sin embargo, se observaron diferentes cinéticas de la respuesta local de citoquinas en lechones inoculados con IAV o PRRSV.
Dado que se ha observado una fuerte correlación positiva entre la concentración local de TNF-α e IL- 10 y la alteración pulmonar, nuestra hipótesis es que estas citoquinas están implicadas en la inducción de lesiones durante la infección por PRRSV e IAV. Sin embargo, no se observó un aumento aparente de la respuesta de las citoquinas pulmonares en los lechones coinoculados simultáneamente con ambos patógenos en comparación con los grupos inoculados únicamente con uno de los dos. También puede explicar que no haya un efecto significativo de la coinfección sobre la afectación pulmonar y la carga de patógenos en comparación con las infecciones simples.
La fuerte correlación entre la concentración local de TNF-α, IFNγ, IL-8 y la carga de SwH1N1 en el pulmón, así como los títulos pulmonares de TNF-α, IL-8 y PRRSV, sugiere que la replicación local de ambos virus también influye en la respuesta local de citoquinas durante la infección.
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