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Para leer más contenidos de porciSapiens Octubre 2021
La pleuroneumonía porcina es una enfermedad infecciosa y altamente contagiosa del tracto respiratorio, causada por Actinobacillus pleuropneumoniae (App), que ocasiona grandes pérdidas económicas a la industria porcina a nivel mundial. Puede afectar a cerdos de todas las edades, aunque es más frecuente en animales de cebo.
El tratamiento de los animales enfermos se lleva a cabo con los antibióticos seleccionados mediante pruebas de sensibilidad antibiótica in vitro tras el aislamiento bacteriano de App a partir de órganos o muestras respiratorias (Imagen 1).
Las pruebas más habituales son la técnica de Kirby-Bauer, comúnmente conocida como antibiograma en disco, y los métodos de determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), como el método por microdilución y el sistema de E-test (Imagen 2).
En general, se ha observado una alta sensibilidad por parte de App a la mayoría de antibióticos registrados para el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria, a excepción de la gentamicina, penicilina y tetraciclina1.
En respuesta a factores estresantes, App es capaz de [registrados]formar biofilm, lo que puede interferir con los mecanismos inmunológicos porcinos y aumentar la resistencia a los antibióticos.
| En el presente trabajo, se evaluó la evolución de la sensibilidad antibiótica de App a lo largo de un periodo de 3 años frente a los principales antibióticos indicados para el tratamiento de la pleuroneumonía porcina. Además, se estudió la relación entre la resistencia antibiótica y la formación de biofilm in vitro por parte de App. |
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EN DISCO (MÉTODO
DE KIRBY-BAUER)
Se estudiaron las diferencias de sensibilidad de App en función del tiempo, la región y la edad a partir de 513 cepas. Así, mediante la técnica de Kirby-Bauer se clasificaron las cepas en sensibles, con sensibilidad intermedia o resistentes a los antibióticos testados.
Se apreció una disminución significativa de la sensibilidad respecto al tiempo (Gráfica 1) en el caso de la gentamicina, penicilina y tetraciclina (prueba de Chi-Cuadrado).
Respecto a la amoxicilina, enrofloxacina, florfenicol y gamitromicina también se detectaron diferencias significativas en función del tiempo. Sin embargo, no se encontró un patrón definido de aumento o disminución de la sensibilidad.
No se encontraron diferencias significativas en la sensibilidad a los antibióticos en función de la edad de los animales o de la localización geográfica de la explotación.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA (CMI)
En base a los datos del estudio de CMI por microdilución y E-test, se obtuvo la CMI50 y CMI90 (Tabla 1), que corresponden a la concentración mínima de antibiótico capaz de inhibir el crecimiento del 50% y 90% de la población bacteriana, respectivamente.
Se pudo inhibir el crecimiento del 90% de las cepas con una concentración de antibiótico inferior al punto de corte clínico en el caso de la amoxicilina, ceftiofur, gamitromicina, marbofloxacina, tildipirosina y tulatromicina, sugiriendo la alta eficacia de estos antibióticos para el tratamiento de la pleuroneumonía porcina.
En el caso de la gentamicina, penicilina y tetraciclina, más del 50% de las cepas analizadas tuvieron valores de CMI superiores al punto de corte clínico, confirmando los datos de alta resistencia de App frente a estos antibióticos obtenidos con la técnica de Kirby Bauer.
Para los antibióticos en los que aparece sensibilidad en la CMI50 y resistencia en la CMI90 (ampicilina, danofloxacina, enrofloxacina, florfenicol, tiamulina y trimetoprimsulfametoxazol) es interesante conocer la distribución de las cepas de App en función del valor de CMI (Gráfica 2).
Para la danofloxacina y enrofloxacina se vio una proporción muy alta de cepas sensibles con valores de CMI bajos, pero también cepas resistentes (21%) con valores de CMI más altos.
Se encontró una distribución normal para el florfenicol y la tiamulina, con un porcentaje de cepas resistentes del 16% y 21%, respectivamente.
El caso de la ampicilina resultó el más relevante, ya que se obtuvieron dos poblaciones de cepas muy sensibles y una población de cepas muy resistentes, siendo el porcentaje total de cepas resistentes del 35%.
| Estos resultados sugieren que para la ampicilina es especialmente importante realizar pruebas de sensibilidad antibiótica para poder seleccionar el tratamiento con un porcentaje de éxito mayor, aunque sería conveniente llevarlas a cabo para todos los antibióticos. |
| MULTIRRESISTENCIA ANTIBIÓTICA
De las 513 cepas de App analizadas, 369 correspondieron a cepas no multirresistentes y 144 a cepas multirresistentes. Es decir, el 28% de las cepas de App presentaron multirresistencia antibiótica, lo que puede suponer una dificultad añadida a la hora de encontrar un tratamiento antibiótico efectivo. |
ENSAYO DE PRODUCCIÓN IN VITRO DE BIOFILM
Para determinar la producción in vitro de biofilm por parte de App2:
Se cultivaron las cepas en placas de 96 pocillos.
Se tiñó el biofilm formado con cristal violeta y se solubilizó.
Se cuantificó en el espectrofotómetro.
La absorbancia es directamente proporcional al biofilm formado, es decir, cuanto mayor es la absorbancia, mayor es la producción de biofilm (Imagen 3).
Se observaron 3 grupos de cepas en función de la producción in vitro de biofilm (Gráfica 4): 50 de las 57 cepas produjeron una concentración baja de biofilm (absorbancia 0,00-0,10), 4 cepas una concentración intermedia (absorbancia 0,12-0,22), y 3 cepas una concentración alta (absorbancia 0,32-0,52).
PRODUCCIÓN DE BIOFILM VS RESISTENCIA ANTIBIÓTICA IN VITRO
No se encontró una asociación in vitro entre ambas variables (prueba U de Mann-Whitney, p-valor<0,05). Sin embargo, esto no significa que la producción de biofilm no interfiera en la eficacia del tratamiento antibiótico.
In vivo, la presencia de biofilm puede, entre otros mecanismos propuestos, impedir o ralentizar la difusión del antibiótico hasta la bacteria.
Sería interesante comparar la efectividad del tratamiento in vivo de las cepas que produjeron una concentración intermedia o alta de biofilm, ya que en caso de no ser efectivo dicho tratamiento se podría combinar con compuestos anti-biofilm3.
| CONCLUSIONES Es fundamental realizar pruebas de sensibilidad antibiótica para seleccionar una terapia antibiótica efectiva frente a App.
En cambio, muestra una alta sensibilidad al ceftiofur, marbofloxacina, tianfenicol, tilmicosina, tildipirosina y tulatromicina, lo que indica que podrían valorarse como tratamiento de primera elección de esta patología, teniendo siempre en cuenta las recomendaciones de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) y las características farmacodinámicas y farmacocinéticas. |
BIBLIOGRAFÍA
1. Gutiérrez-Martín CB, Blanco NG del, Blanco M, Navas J, Rodríguez-Ferri EF. Changes in antimicrobial susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from pigs in Spain during the last decade. Veterinary Microbiology. 2006; 115(1–3):218–22
2. Coffey BM, Anderson GG. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 2014; 1149:631–41.
3. Hathroubi S, Loera-Muro A, Guerrero-Barrera AL, Tremblay YDN, Jacques M. Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms: Role in pathogenicity and potential impact for vaccination development. Vol. 19, Animal Health Research Reviews. Cambridge University Press; 2018. p. 17–30.
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La multirresistencia antibiótica se define como la 
