Métodos in vitro y ex vivo para determinar valor nutri-fisiológico de insumos

 Además, el uso de métodos in vivo, especialmente los que implican el uso de animales modificados quirúrgicamente, requiere instalaciones, equipos y formación de técnicos especializados, y requiere mucha mano de obra.

• También existe una creciente preocupación ética con respecto al uso de animales modificados quirúrgicamente y otros métodos invasivos para recolectar muestras y datos en estudios de nutrición in vivo.
• Aunque muchas organizaciones internacionales proporcionan directrices y requisitos reglamentarios para el cuidado humanitario y el uso de animales en experimentos científicos, se necesitan metodologías alternativas adecuadas a los experimentos in vivo para superar algunas de las desventajas del uso de ensayos in vivo y evitar posibles preocupaciones poco éticas.

Se han desarrollado y utilizado varios métodos in vitro para estimar la digestibilidad de los nutrientes en los ingredientes de los piensos durante las últimas décadas.

El uso de NIRS se ha centrado principalmente en determinar el contenido total de nutrientes de los ingredientes del alimento y alimento completos, existe un interés considerable en aplicar esta tecnología para estimar la digestibilidad y biodisponibilidad de los nutrientes.

También se han desarrollado y utilizado varios otros métodos in vitro para estimar la digestibilidad de los nutrientes en los alimentos para cerdos, que incluyen:

1. celda de diálisis
2. colorimétrico
3. caída de pH y pH-stat
4. filtración métodos

Los métodos de células de diálisis no se han utilizado ampliamente debido al alto costo de los tubos de diálisis, pero estos procedimientos implican la digestión enzimática de proteínas acompañada de la eliminación continua de compuestos de bajo peso molecular mediante diálisis para evitar que los productos finales de la digestión inhiban las actividades enzimáticas.

Los métodos colorimétricos se han utilizado principalmente para estimar la digestibilidad del almidón en los alimentos procesados ​​y la digestibilidad del AA en los DDGS, pero se ha demostrado que las puntuaciones de color están poco asociadas con la SID de la lisina y otros AA entre las fuentes de DDGS de maíz.

La caída de pH y el pH-stat  son procedimientos analíticos relativamente sencillos que se han utilizado para estimar la calidad de las proteínas en los ingredientes de piensos procesados, como la harina de soja, y que implican medir el cambio de pH después de la digestión enzimática.

• Estudios han demostrado que los datos obtenidos de estos métodos in vitro estaban poco correlacionados con los valores in vivo de varios tipos de ingredientes de piensos.

La espectroscopia de reflectancia del infrarrojo cercano es una técnica rápida, físicamente no destructiva y económica que se está adoptando rápidamente en la industria mundial de piensos para estimar con precisión el contenido de nutrientes de los ingredientes de los alimentos.

La exactitud y precisión de las estimaciones NIRS dependen de la solidez y el tamaño del conjunto de datos utilizado para crear el modelo de calibración, contenido total y digestible de AA y valores energéticos de los ingredientes de piensos y piensos acabados para cerdos.

También se está explorando el uso de la tecnología NIRS para medir la biodisponibilidad de nutrientes en varios alimentos.

• Por ejemplo, se han desarrollado calibraciones NIRS para medir la lisina reactiva y el grado de daño por calor en los granos de destilería de trigo Sin embargo, como ocurre con todos los tipos de procedimientos analíticos, NIRS tiene varias ventajas y desventajas en comparación con las técnicas tradicionales de análisis químico.

Ventajas

1. Escaneo rápido de las muestras (menos de 1 min).
2. Solo se necesita una pequeña cantidad de muestra para el análisis.
3. Bajo costo porque no se necesitan reactivos químicos y un solo operador puede analizar una gran cantidad de muestras en un corto período de tiempo.
4. Los resultados son muy reproducibles.
5. Se pueden determinar múltiples analitos en una operación.
6. Mínimo (secado y trituración) o no se necesita preparación de la muestra.
7. El equipo se puede utilizar fácilmente en diferentes entornos (por ejemplo, procesamiento de ingredientes, cosecha de granos, laboratorio, fábrica de piensos).
8. Alta accesibilidad para la captura y almacenamiento de datos en línea.
9. Algunas sondas ópticas permiten analizar muestras in situ.
10. El equipo es portátil.

Desventajas

1. Es un método secundario que requiere el uso de datos derivados de análisis químicos o estudios in vivo como valores de referencia.
2. Se requiere una gran cantidad de muestras con composición variable y datos con gran variación para calibraciones precisas y sólidas.
3. Se requiere personal altamente capacitado para la calibración y validación de los resultados.
4. Se requiere un mantenimiento y una actualización continuos de la base de datos de calibración.
5. Los cambios en la estructura química de los nutrientes que ocurren durante el proceso de digestión no se pueden predecir usando la tecnología NIRS.
6. Alto costo inicial para la compra de instrumentos NIRS.

Métodos cerrados de filtración in vitro

Se han desarrollado métodos de filtración cerrada o multienzimáticos para imitar parte o todo el proceso de digestión del tracto gastrointestinal in vivo y se utilizan para estimar la materia seca y la digestibilidad de nutrientes de varios ingredientes mediante el uso de enzimas únicas o múltiples y la recolección de residuos no digeridos.

Históricamente, se desarrollaron y utilizaron varios métodos de incubación multienzimáticos de dos pasos, que incluyen pepsina-pancreatina], pepsina-pronasa, pepsina-tripsina o pepsina-líquido yeyunal para estimar la PC digestibilidad o digestibilidad ileal de AA.

El uso del procedimiento de Boisen y Fernandez ha dado como resultado un análisis in vitro en dos etapas altamente reproducible de la digestibilidad de proteínas y AA de los ingredientes del pienso.

• Es importante reconocer que cuando se utiliza el procedimiento de dos pasos, los datos de PC digestible in vitro son mayores que los valores in vivo porque no se producen pérdidas de nitrógeno endógeno.
• Curiosamente, cuando se estimaron las pérdidas de nitrógeno endógeno en 17 alimentos diferentes y se incluyeron en las ecuaciones in vitro, los resultados estuvieron altamente correlacionados con la digestibilidad ileal in vivo de proteínas y AA en cerdos (R 2 = 0,92;).

El método enzimático de dos pasos también se ha aplicado para predecir la STTD in vitro de fósforo (P) en estudios avícolas, pero también se puede aplicar en modelos porcinos in vitro porque el intestino grueso no juega un papel en el proceso de digestión del fósforo de la dieta.

Zhu et al. informan alta correlación (r=0,91) entre la digestibilidad de P in vitro y la STTD in vivo de P entre 13 fuentes de harinas de proteína animal extraídas para cerdos. Estos resultados sugieren que el ensayo de digestibilidad de P in vitro de dos pasos es capaz de predecir bien la digestibilidad de P in vivo de subproductos de proteínas animales alimentados a cerdos.

Los dos primeros pasos de este método implican incubaciones consecutivas de los ingredientes del alimento con varias enzimas que imitan la digestión en el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso.

• Cada paso de incubación se realiza a un pH, temperatura y tiempo óptimos, y los residuos no digeridos se recogen por filtración, se desgrasan con etanol y acetona y se analizan para determinar el contenido de materia seca y nutrientes.

El tercer paso implica la medición de la desaparición del sustrato durante la fermentación, junto con la cinética de fermentación de los sustratos y la producción de ácidos grasos de cadena corta.

• Se han validado estudios in vitro para simular la fermentabilidad del intestino grueso utilizando muestras fecales frescas de cerdos. El desarrollo y uso de sistemas automatizados de producción de gas ha mejorado la medición durante la parte de fermentación del ensayo, y no se observaron diferencias en la cinética de fermentación y la producción de metabolitos microbianos entre los sistemas de registro de fermentación in vitro manuales y automáticos que utilizan inóculos fecales porcinos.

A pesar de estos resultados alentadores, ninguno de estos métodos in vitro simula completamente los complejos eventos bioquímicos y fisiológicos que ocurren durante los procesos in vivo de la digestión de la energía y los nutrientes.

Hay varias razones para esto.

1. los efectos de los factores antinutricionales rara vez se imitan en el sistema in vitro, pero pueden tener efectos significativos en la digestión de nutrientes in vivo.
2. el efecto de la FD sobre la ingesta de alimento y el tiempo de tránsito no se puede replicar con sistemas enzimáticos in vitro de dos o tres pasos.
3. los efectos de la microflora intestinal son difíciles de simular, pero el microbioma puede desempeñar un papel importante en los procesos de digestión y fermentación.

La suposición de que toda la fibra soluble es digerible no es correcta, porque puede contener grandes cantidades de pequeños péptidos comúnmente asociados con proteínas tratadas térmicamente, que pueden no ser absorbidos.

En general, los datos derivados de estos procedimientos in vitro no coinciden con las determinaciones in vivo de la digestibilidad de los nutrientes de los ingredientes del pienso.

Sin embargo, los ensayos in vitro de dos y tres pasos pueden proporcionar un análisis relativamente rápido y rentable, y servir como métodos de cribado inicial razonables para evaluar la magnitud de las diferencias de digestibilidad y fermentabilidad entre diferentes fuentes de ingredientes.

Cámaras de uso

El sistema de cámara de uso se desarrolló e introdujo por primera vez en la década de 1950 y se utiliza para mediciones basadas en difusión o electrofisiología.

En lo que respecta a la nutrición, se han utilizado principalmente para estudiar la permeabilidad intestinal y la función de barrera intestinal en lechones destetados.

Las principales ventajas de utilizar cámaras de uso son el estudio de la permeabilidad regional (duodeno, yeyuno, íleon o colon) y la función de barrera.

Sin embargo, el principal desafío técnico de realizar experimentos con cámaras de uso es la cantidad limitada de tiempo (hasta 2,5 h) para mantener tejido intestinal viable, que no es suficiente para la investigación de la alteración reversible de las uniones estrechas y las determinaciones extensivas del metabolismo.

Enteroides

El uso de cultivos de células intestinales ofrece muchos beneficios potenciales para el estudio de mecanismos específicos y complejos que involucran la composición química y nutricional de los ingredientes de los alimentos asociados con las respuestas fisiológicas de los cerdos.

Estos cultivos de células a menudo consisten en un solo tipo de célula y se cultivan en una monocapa, lo que proporciona una estructura bidimensional simple para realizar experimentos e interpretar resultados, pero son incapaces de proporcionar información para comprender las relaciones complejas entre diversos tipos de células y estructuras morfológicas. del intestino delgado.

Los sistemas de cultivo celular bidimensionales no representan las complejas estructuras tridimensionales de las células epiteliales intestinales y pueden mutar fácilmente durante el establecimiento.

En comparación con otros modelos in vitro, el uso de enteroides brinda la oportunidad de estudiar los efectos de la dieta y los nutrientes en el crecimiento y desarrollo intestinal, el transporte de iones y nutrientes, las funciones secretoras y de absorción, la barrera intestinal, la diferenciación celular, las enfermedades intestinales, la expresión génica y otras respuestas de interés en el tracto gastrointestinal.

Además, los enteroides:

1. poseen la mayoría de los tipos de células del epitelio intestinal
2. se puede establecer rápidamente a partir de células madre adultas y células madre pluripotentes
3. son estables en cultivos a largo plazo (al menos 1,5 años) y no muestran cambios genéticos o fisiológicos
4. requieren un solo donante de intestino, lo que reduce el número de animales necesarios para la experimentación
5. los cultivos se pueden multiplicar y mantener durante varios meses en el laboratorio una vez desarrollados
6. tienen problemas éticos y costos mínimos en comparación con el uso de métodos invasivos in vivo. Sin embargo, también existen varias desventajas para el uso de enteroides en experimentos nutricionales.

En primer lugar, no existen protocolos ni directrices estándar para establecer cultivos celulares de enteroides. Segundo, El establecimiento y mantenimiento de cultivos de enteroides puede resultar más caro en comparación con las líneas celulares convencionales.

Por último, la posible variación entre los donantes individuales de células madre y los protocolos puede provocar una mala interpretación de los resultados experimentales.

El conocimiento y el interés en el uso de tecnologías basadas en enteroides continúa aumentando en relación con sus muchas ventajas para la investigación en nutrición animal.

Aunque los estudios limitados han utilizado modelos de enteroides en la investigación de la nutrición porcina, los enteroides representan una tecnología ex vivo prometedora que podría mejorar en gran medida nuestro conocimiento de las características nutri-fisiológicas de los ingredientes de los piensos para cerdos en el futuro.

Articulo completo:

Shurson, G.C.; Hung, Y.-T.; Jang, J.C.; Urriola, P.E. Measures Matter—Determining the True Nutri-Physiological Value of Feed Ingredients for Swine. Animals 2021, 11, 1259. https://doi.org/10.3390/ani11051259

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