Porcisapiens
Para leer más contenidos de porciSapiens Octubre 2021
Uno de los recursos terapéuticos más comunes ante brotes en explotaciones ganaderas son los compuestos antimicrobianos, siempre bajo prescripción veterinaria y sujetos a un detallado control.
Sin embargo, su entrada en la cadena alimentaria en forma de residuos a través de la carne puede generar cuadros alérgicos y alteraciones en la microbiota intestinal, contribuyendo también a la generación de antibiorresistencias (Baynes et al., 2016; Lan et al., 2017; Cheng et al., 2019).
A pesar de que la generación de resistencias a los antimicrobianos es el inconveniente más importante, poco se sabe de la toxicidad de sus derivados tras el cocinado (Nguyen et al., 2015) o de las consecuencias de los antimicrobianos con efecto pro-oxidante (Elzagallaai et al., 2020).
Con el objeto de atajar el problema y ofrecer seguridad a los consumidores, la Unión Europea ha establecido:
Un amplio marco legal a través de la regulación de los medicamentos de uso veterinario (Reglamento 2004/726/EC).
La obligatoriedad de fijar periodos de supresión por los fabricantes de dichos medicamentos (Directiva 2001/82/EC).
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE
RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS
EN CARNE
En la actualidad, existe un amplio abanico de métodos para el análisis de residuos antibióticos en carne. Habitualmente, los programas de vigilancia incluyen un método de cribado que permite analizar numerosas muestras en poco tiempo y con un bajo precio (Pikkemaat, 2009).
Los métodos de cribado detectan un amplio espectro de antimicrobianos a los niveles que marca la legislación (LMRs) y no deben dar más de un 5% de falsos negativos.
En caso de encontrarse una muestra positiva, ésta debe confirmarse mediante un método validado (Reglamento de Ejecución (UE) 2021/808).
MÉTODOS DE CRIBADO
Entre los métodos de cribado, hay varios tests comercializados para la detección de residuos antimicrobianos basados en la inhibición del crecimiento de microorganismos como Geobacillus stearothermophilus (Pikkemaat, 2009).
| Algunos de estos métodos como el test rápido de screening para músculo/carne* han sido validados para músculo (Mata et al., 2014) y automatizados con la inclusión de un sistema de lectura** (Mata et al., 2016). |
*Explorer®
**e-Reader®
Aunque efectivo, el monitoreo de la carne se lleva a cabo post mortem, de forma que, en el caso de obtener un resultado positivo, las canales son confiscadas y destruidas, con el consiguiente impacto medioambiental y económico para el productor.
Es por ello que llevar a cabo estos análisis de forma previa al sacrificio del animal está recibiendo atención en los últimos años (Jones et al., 2014; Wu et al., 2021). Para ello, es importante elegir [registrados]la matriz más adecuada:
Fácil obtención de animal vivo
Representativa del contenido de antibióticos en músculo
| Un estudio reciente (Serrano et al., 2020) demostró que la sangre cumple ambos requisitos, por lo que se propuso la adaptación de un test rápido de screening para músculo/carne como método de cribado ante mortem, evitando así la aparición de residuos antibióticos en la carne de forma previa al sacrificio del animal. |
NUEVO TEST RÁPIDO
PARA SANGRE
El nuevo test rápido para sangre*** es un test cualitativo que da resultados de tipo binario (positivo/negativo) en relación a la existencia de sustancias inhibidoras del crecimiento microbiano en sangre de animales de producción.
Se presenta en un tubo que contiene formas esporuladas de Geobacillus stearothermophilus, un medio de crecimiento y un indicador de pH que permite valorar los cambios en el pH del medio asociados al crecimiento del microorganismo. Los cambios de color se miden con un sistema de lectura** que además actúa como incubador a 65°C.
Llevar a cabo el test es tan sencillo como añadir 100 μL de suero sanguíneo a un tubo e incubarlo durante 20 minutos a temperatura ambiente, lavar con agua destilada e introducirlo en el sistema de lectura, obteniéndose resultados en aproximadamente 180 minutos.
***Test Explorer®-Blood
PARÁMETROS Y VALIDACIÓN DEL NUEVO TEST RÁPIDO PARA SANGRE
LÍMITES DE DETECCIÓN (LDs)
ANTIBIÓTICOS UTILIZADOS EN EL ESTABLECIMIENTO DE LOS LDs
Para acotar el estudio, se eligieron una o dos moléculas de cada una de las principales familias de antimicrobianos de acuerdo a los datos publicados en la base del CIMAVET para porcino (CIMAVET, 2020).
Esta base de datos incluye las moléculas autorizadas con mayor frecuencia dentro de cada familia, que fueron seleccionadas en el estudio de validación como representantes de la familia.
La amoxicilina se eligió en representación de las penicilinas (el 72% de los productos autorizados de esta familia contienen amoxicilina).
El ceftiofur se seleccionó para representar a las cefalosporinas (82%).
La doxiciclina y oxitetraciclina se eligieron en representación de las tetraciclinas (78%).
La sulfadiazina representó a las sulfamidas (60%).
La tilosina fue seleccionada para representar a los macrólidos (58%).
La neomicina y apramicina representaron a los aminoglucósidos (42%).
Lincomicina.
Los fenicoles y quinolonas no se incluyeron en el estudio por la baja sensibilidad de G. stearothermophilus frente a estos compuestos (Pikkemaat, 2009).
DETERMINACIÓN DE LOS LDs
Los LDs se determinaron a partir de muestras de suero sanguíneo contaminadas artificialmente con 3-4 concentraciones de cada antimicrobiano (Gráfica 1).
Como no existen guías específicas para la validación de métodos de cribado para la detección de antibióticos en sangre, se tomaron como referencia las establecidas para leche (ISO 13969: 2003).
Esta norma indica que cuando se emplea un sistema de lectura automático, se deben realizar entre 3 y 5 réplicas para cada sustancia y nivel testado.
VALIDACIÓN CON MUESTRAS NATURALMENTE CONTAMINADAS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PREPARACIÓN DE LA MATRIZ PARA ANÁLISIS
De acuerdo a los resultados obtenidos por Serrano et al. (2020), la sangre resultó ser la matriz más adecuada para el análisis de residuos antimicrobiano in vivo. De las preparaciones testadas (dilución en tampón, obtención de suero y desproteinización de suero) se eligió el suero por su fácil obtención.
VALIDACIÓN CON MUESTRAS NATURALMENTE CONTAMINADAS
De acuerdo a los resultados obtenidos por Serrano et al. (2020), la sangre resultó ser la matriz más adecuada para el análisis de residuos antimicrobiano in vivo. De las preparaciones testadas (dilución en tampón, obtención de suero y desproteinización de suero) se eligió el suero por su fácil obtención.
ESTABLECIMIENTO DE PARÁMETROS DE LECTURA DEL NUEVO TEST RÁPIDO PARA SANGRE
Además, la lectura visual de resultados puede dar lugar a errores en la interpretación y variaciones en los resultados obtenidos entre laboratorios y usuarios (Gaudin et al. 2009).
Para superar estos aspectos, el nuevo test rápido para sangre cuenta con un sistema de medición automática** para la detección de antimicrobianos en carne.
Este equipo incluye un incubador y un sistema óptico de medición para monitorizar los cambios de color, mientras que un software controla las funciones, detecta el punto de parada del ensayo y da un resultado objetivo.
La determinación del punto de parada y el cut-off son esenciales para conseguir un rendimiento óptimo del test. Con este propósito, se testaron sueros blancos con el nuevo test rápido para sangre y sus cinéticas se midieron con el sistema de lectura.
ESTABLECIMIENTO DEL TIEMPO ÓPTIMO DE FINALIZACIÓN DEL ENSAYO Y LECTURA DE LOS RESULTADOS
El tiempo óptimo de finalización del ensayo es el momento en el que debe pararse el ensayo y realizarse la lectura para obtener los resultados más adecuados.
Se decidió parar en el valor de 35, momento en el que se obtiene la mejor correlación entre la máxima sensibilidad y la mínima variabilidad en el ensayo.
En caso de parar muy pronto (infra-incubación), aumentaría la sensibilidad, pero también la variabilidad, lo que haría necesario incrementar el cut-off para reducir la tasa de falsos positivos (Wu et al., 2021).
Tiempos mayores de incubación reducirían la variabilidad, pero también la sensibilidad del test especialmente en el caso de bacteriostáticos, aumentando el riesgo de obtención de falsos negativos.
ESTABLECIMIENTO DEL CUT-OFF O PUNTO DE CORTE
Una vez establecido el punto de parada, se estableció el cut-off, valor por encima del cual las muestras se consideran positivas, es decir, contienen un analito por encima de una concentración específica. Para ello, se analizaron 344 muestras de suero sanguíneo, obteniéndose un valor medio de 36 y una desviación estándar de 6.
Las guías de la CRL (Community Reference Laboratories Residues, 2010) proponen aplicar un factor de seguridad de 1,64 veces la SD. Sin embargo, el nuevo test rápido para sangre está pensado para ser utilizado a niveles previos al sacrificio, donde no hay métodos confirmatorios fiables. Por ello, se decidió aplicar un factor de seguridad de 3 veces la desviación estándar y estableciéndose el cut-off en 55.
CUANDO EL NEGATIVO ALCANZA EL VALOR DE 35, TODAS LAS MUESTRAS CON LECTURAS SUPERIORES A 55 SE CONSIDERAN POSITIVAS
LÍMITES DE DETECCIÓN (LDs) EN SUERO SANGUÍNEO DE CERDO
La Gráfica 3 resume el LD calculado para suero sanguíneo con el nuevo test rápido para sangre acoplado al sistema de lectura. En general, los valores obtenidos para el LD se alejaron del cut-off (fijado en 55 unidades), signo de que el método es muy fiable a la hora de discriminar muestras positivas y negativas.
En general, el suero sanguíneo guarda una buena correlación con la concentración de antibióticos en músculo, a excepción de para sulfametoxipiridazina, que presenta concentraciones superiores en sangre (Serrano et al., 2020).
Sin embargo, los LDs del test rápido de screening para músculo/carne y el nuevo test rápido para sangre son similares para las sulfamidas, por lo que en caso de que el método diese un falso positivo debido a ello, se debe tener en cuenta que no supondría ningún riesgo para la salud del consumidor.
VALIDACIÓN CON MUESTRAS NATURALMENTE CONTAMINADAS
AMOXICILINA
Las muestras con concentraciones de amoxicilina por debajo del LD del método cromatográfico (LC-MS/ MS) dieron resultados negativos con el nuevo test rápido para sangre (Gráfica 4), mientras que muestras con mayores concentraciones resultaron positivas.
Sin embargo, dos muestras con 58 y 73 ppb dieron resultados negativos, lo cual es extraño considerando que el LD del test rápido para sangre*** para este compuesto es 10-15 ppb, al igual que el del test rápido de screening para músculo/carne* (Mata et al., 2014). El re-análisis por LC-MS/ MS mostró la inexistencia de amoxicilina en las muestras.
LOS ANÁLISIS CONFIRMATORIOS DEBERÍAN LLEVARSE A CABO TAN PRONTO COMO SEA POSIBLE TRAS EL CRIBADO, EVITANDO ASÍ QUE CONDICIONES DE CONSERVACIÓN COMO LA TEMPERATURA DE CONGELACIÓN, TIEMPO DE ALMACENAMIENTO O PREPARACIÓN DE LA MUESTRA, TENGAN UN IMPACTO EN LA ESTABILIDAD DE LOS ANTIMICROBIANOS (Verdon et al., 2000)
OXITETRACICLINA
La Gráfica 5 muestra los resultados obtenidos para la oxitetraciclina. Las muestras con un elevado contenido dieron resultados positivos, e incluso algunas muestras alrededor del LMR (71 y 102 ppb), mientras que otras no pudieron detectarse (83 y 89 ppb).
Estos resultados concuerdan con los obtenidos para muestras contaminadas de forma artificial, donde sólo la mitad de las réplicas fueron positivas a 100 ppb mientras que el 100% lo fueron a 200 ppb.
SULFAMETOXIPIRIDAZINA
En el caso de la sulfametoxipiridazina, se encontraron resultados positivos incluso por debajo de 50 ppb (Gráfica 6).
Esta molécula no se incluyó en la validación con muestras contaminadas de forma artificial, pero los resultados son consistentes con el LD descrito para otras sulfamidas incluidas en el estudio de validación, donde el 100% de las réplicas fueron positivas a 100 ppb, lo que indica que algunas muestras podrían ser positivas a menores niveles.
| De acuerdo a la adaptación del método y su validación, el nuevo test rápido para sangre se propone como una herramienta adecuada para la detección in vivo de residuos antimicrobianos, útil para prevenir la llegada de animales contaminados a matadero, evitando así la entrada de sus productos en la cadena alimentaria y protegiendo los intereses de todos los actores implicados de la granja a la mesa. |
El estudio propone un nuevo método para el análisis de residuos antibióticos en animal vivo, de forma que se evite el sacrificio de animales contaminados y se minimice la entrada de estos compuestos en la cadena alimentaria.
El nuevo método ha sido validado, demostrando que el nuevo test rápido para sangre acoplado al sistema de lectura es un método adecuado para la detección precoz de residuos antimicrobianos en animales de producción. Su sencillez de manejo, breve tiempo de ensayo y las ventajas asociadas a la detección ante mortem hacen del nuevo test rápido para sangre una herramienta pionera para el cribado de residuos antimicrobianos en animal vivo, evitando su aparición en carne, protegiendo al mismo tiempo la economía de los productores y la salud de los consumidores.
El proyecto ha sido cofinanciado al 65% por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a través del Programa Interreg V-A España-Francia-Andorra (POCTEFA 2014-2020).
Más información del proyecto POCTEFA-TESTACOS en www.testacos.com
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