El objetivo de este trabajo fue estudiar la prevalencia y distribución de Astrovirus porcino (PAstV), Kobuvirus porcino (PKoV), Torovirus porcino (PToV), Orthoreovirus de mamíferos (MRV) y Mastadenovirus porcino (PAdV), así como su asociación con virus ampliamente reconocidos como causantes de diarrea en porcino como coronavirus (CoV) y rotavirus (RV) en brotes de diarrea en explotaciones porcinas españolas. Además, se caracterizó genéticamente una selección de las cepas virales.
Las enfermedades entéricas causadas por virus son muy prevalentes y tienen un impacto negativo en la producción porcina1.
Los coronavirus (CoV) y los rotavirus (RV) son los virus más comunes y reconocidos como responsables de la diarrea en cerdos2-4(Tabla 1).
ROTAVIRUS
Entre los RV, Rotavirus A (RVA)y Rotavirus C (RVC) son las especies más relevantes3 y están implicados principalmente en brotes de diarrea en lechones lactantes y destetados, aunque pueden detectarse en todas las fases de la producción porcina3.
CORONAVIRUS
Más recientemente, un virus recombinante entre el VGET y el VDEP, conocido como Coronavirus entérico porcino (SeCoV), ha sido identificado en granjas porcinas europeas7-10, causando una enfermedad diarreica idéntica a la causada por el VGET y el VDEP3,11.
Asimismo, otros dos CoV porcinos, el Deltacoronavirus porcino (PDCoV)12 y el Coronavirus del síndrome de diarrea aguda porcina (SADS-CoV)13,14, un Alphacoronavirus, también se han descrito como causa de brotes de diarrea, aunque nunca se han detectado en explotaciones porcinas europeas.
OTROS VIRUS ENTÉRICOS
Además de estos agentes infecciosos, en granjas porcinas se han detectado otros virus entéricos (Tabla 1)en cerdos con diarrea en todo el mundo, aunque su papel etiológico sigue sin estar claro:
Astrovirus porcino (PAstV)15-20
Kobuvirus porcino (PKoV)16,21-24
Torovirus porcino(PToV)25-29
Orthoreovirus de los mamíferos (MRV)30-34
Mastadenovirus porcino (PAdV)1,35-37
Estos virus se identifican frecuentemente en coinfecciones con CoV y RV4,38-45, pero también se detectan habitualmente en animales sanos39,46-50.
La enteropatogenicidad de PAstV, MRV y PAdV se ha demostrado en lechones convencionales infectados experimentalmente51-55, pero no conocemos la existencia de desafíos experimentales con PKoV o PToV.
VIRUS ENTÉRICOS PORCINOS ENESPAÑA
Los objetivos de este trabajo fueron:
1.Estudiar la prevalencia y distribución de los virus entéricos PAstV, PKoV, PToV, MRV y PAdV en brotes de diarrea en explotaciones porcinas de España.
2.Identificar su asociación con virus ampliamente reconocidos como causantes de diarrea, como CoV y RV.
3.Caracterizar una selección de las cepas virales obtenidas para investigar sus relaciones filogenéticas.
En conjunto, los resultados obtenidos aportan información sobre la etiología de las enfermedades entéricas en porcino que puede ser utilizada para diseñar e implementar estrategias de diagnóstico y control adecuadas.
MATERIAL Y MÉTODOS
RECOGIDA Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
El estudio se llevó a cabo [registrados]entre enero de 2017 y octubre de 2020 en 206 explotaciones porcinas españolas con brotes de diarrea que afectaban a:
Lechones lactantes (<21 días): 66 explotaciones
Lechones de postdestete o en transición (21-70 días): 64 explotaciones
Cerdos de engorde (>70 días): 76 explotaciones
De cada granja se recibieron 2-6 muestras de heces individuales y el veterinario responsable de la explotación clasificó el brote, en función de criterios clínicos como la velocidad de progresión de la enfermedad o la respuesta a los antimicrobianos, como:
Sin sospecha de etiología viral
Con sospecha de etiología viral
Las muestras individuales se mezclaron para preparar una muestra conjunta de heces por granja que se diluyó 1:2 (v/v) en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), se homogeneizó en vórtex y se clarificó mediante centrifugación.
El ácido nucleico se extrajo a partir de 140 μl del sobrenadante y utilizando un kit comercial (QIAMP Viral RNA and DNA Mini Kit, QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la extracción se almacenó a -80 °C hasta su uso.
DETECCIÓN MOLECULAR DE VIRUS ENTÉRICOS PORCINOS
Se llevaron a cabo cuatro PCRs de transcripción reversa o RT-PCR múltiplex utilizando el kit Verso 1-Step RT-PCR ReddyMix (Thermo Scientific) para la detección de:
VDEP
VGET
SeCoV (detección simultánea del gen S del VDEP y del gen N del VGET)
RVA
RVC
PToV
PAstV
PKoV
MRV
PAdV
Las reacciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: 50 °C durante 30 min, 95 °C durante 2 min, 45 ciclos a 95 °C durante 20 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min y 30 s, seguidos de un paso final de extensión a 72 °C durante 10 min.
Los productos de la RT-PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5% con RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology, Inc.) y se compararon con las longitudes esperadas para los fragmentos.
SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO
Se seleccionaron 14 muestras para su secuenciación en función de los resultados de la RT-PCR (muestras con el mayor número de virus diferentes detectados).
De cada una de ellas se extrajo el ARN total empleando TRIzol LS (Thermo Scientific) y se llevó a cabo la secuenciación en el Servicio de Genómica y Bioinformática (SGB) de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB), sin utilizar ningún cebador ni paso de amplificación previo, en la plataforma Illumina Miseq.
Finalmente, las secuencias obtenidas fueron alineadas y comparadas filogenéticamente con otras secuencias completas disponibles en la plataforma GenBank.
Las relaciones filogenéticas entre secuencias se analizaron con el programa informático MEGA1171, mediante el algoritmo de Neighbor- Joining (NJ), utilizando el modelo de máxima verosimilitud compuesta y 10.000 réplicas bootstrap para estimar la confianza de las ramas internas de los árboles.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los análisis estadísticos de los datos se realizaron mediante las pruebas exacta y ANOVA de Fisher utilizando Epi InfoTM para un nivel de confianza del 95%.
RESULTADOS
PREVALENCIA Y DISTRIBUCIÓN DE LOS DISTINTOS VIRUS ENTÉRICOS PORCINOS EN LOS BROTES DE DIARREA EN ESPAÑA
Se detectó al menos uno de los virus entéricos investigados en 160 de los 206 brotes investigados (77,7%).
PAstVfue el virus más frecuentemente detectado (48,5%; n = 100), seguido de PKoV (27,2%; n = 56), VDEP (19,9%; n = 41), PAdV (14,1%; n = 29), RVA (13,6%; n = 28), PToV (11,2%; n = 23), RVC (6,3%; n = 13) y MRV (4,4 %; n = 9).
NO SE DETECTARON EN NINGUNA DE LAS EXPLOTACIONES INVESTIGADAS EL VGET NI EL SeCoV
La prevalencia de brotes de diarrea positivos (un resultado positivo para al menos uno de los virus analizados) fue similar (p = 0,787) entre los periodos de lactación (75,8%, 50 de 66), postdestete-transición (76,6%, 49 de 64) y engorde (80,3%, 61 de 76). Sin embargo, se observaron diferentes patrones de distribución por edades para cada uno de los virus investigados (Figura 1).
La detección de PAstV y RVA fue significativamente menor en los brotes de diarrea en lactación en comparación con los brotes de postdestete-transición (p < 0,001 y p = 0,025, respectivamente) y de engorde (p < 0,001 y p = 0,036, respectivamente).
En cambio, los PKoVfueron más prevalentes en lactación y postdestete que en el engorde (p < 0,001), mientras que los RVCsolo se detectaron en los brotes de diarrea que afectaron a lechones lactantes.
PToV y PAdV se detectaron con mayor frecuencia en los brotes de engorde que en los de lactación (p = 0,016 y p = 0,005, respectivamente) y se observó una tendencia similar para VDEP y MRV, aunque sin significación estadística.
LA MAYORÍA DE LOS BROTES INVESTIGADOS (50,0%; 103 DE 206) SE PRODUJERON DURANTE EL PRIMER TRIMESTRE EN COMPARACIÓN CON EL RESTO DEL AÑO (P < 0,001)
La distribución estacional fue clara para el VDEP que se detectó con mayor frecuencia durante el invierno (de enero a marzo) (p = 0,011), pero no se observó para ninguno de los otros virus entéricos investigados (Figura 2).
El riesgo de resultado positivo a, al menos, uno de los virus analizados fue mayor en los brotes en los que el veterinario clínico indicó que existía sospecha de etiología viral (OR= 2,52; IC 95%: 1,27-5,04) en comparación con los brotes sin sospecha vírica (85,4% frente a 69,9%).
Así, la prevalencia de cada uno de los virus investigados fue mayor en los brotes con sospecha de etiología viral, con la excepción de PKoV, RVA y RVC (Figura 3), aunque solo se alcanzaron diferencias estadísticamente significativas para el VDEP (p < 0,001) y el PAdV (p = 0,002).
PREVALENCIA Y DISTRIBUCIÓN DE LAS COINFECCIONES VÍRICAS EN LOS BROTES DE DIARREA EN ESPAÑA
En 69 de los 206 brotes analizados (33,5%) se detectó un único agente viral, mientras que 56 (27,2%) presentaron coinfección con dos virus al mismo tiempo y 35 (17,0%) fueron positivos a más de dos (hasta 5 especies víricas diferentes detectadas simultáneamente en tres granjas distintas).
La detección de un único agente víricofue más frecuente en los brotes de diarrea en lactación que en los de postdestete (26,6%, 17 de 64, p = 0,019) y engorde (28,9%, 22 de 76, p = 0,031).
Los brotes con dos o más virus coinfectando fueron más prevalentes en postdestete (50,0%, 32 de 64, p = 0,017) y engorde (51,3%, 39 de 76, p = 0,009) en comparación con lactación (30,3%, 20 de 66).
Los brotes que presentaban dos o más virus en coinfección fueron más frecuentes en los brotes con sospecha de etiología vírica según los criterios del veterinario responsable de la explotación (55,3% frente a 33,0%, p = 0,001).
Tal y como se muestra en la Tabla 2, PAstV y PKoV se detectaron en casi el 30% de los brotes positivos como infección única, mientras que PToV, MRV y PAdV se detectaron en más del 90% de los brotes positivos coinfectando con el VDEP, RV u otros virus entéricos.
Las combinaciones virales más frecuentes (Top 8) se muestran en la Tabla 3.
Una vez más, se observó una clara distribución en función de la edad, siendo las coinfecciones con PAstV más prevalentes en los brotes de postdestete-transición y engorde y las coinfecciones con PKoV en los brotes en lactación.
En la Figura 4 se muestran los virus más frecuentemente asociados con el VDEP, RVA y RVC.
El PAstV se identificó en más del 50% de los brotes del VDEP y RVA, mientras que el RVC coinfecta, principalmente, con el PKoV, probablemente como consecuencia del patrón dependiente de la edad de estas infecciones.
La comparación de la prevalencia de cada uno de los virus investigados entre los brotes positivos y negativos a VDEP, RVA y RVC revela que los PToV se detectaron más comúnmente en los brotes VDEP y RVA positivos (p = 0,021 y p = 0,005, respectivamente) mientras que la detección de PAstV fue más común en las granjas RVA positivas (p = 0,027).
SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS FILOGENÉT ICO DE PAstV, PKoV Y PToV
Los resultados de la secuenciación de nueva generación (NGS) en 14 muestras de heces se muestran en la Tabla 4.
Se obtuvo el genoma completo o casi completo de 24 virus, incluyendo PAstV2 (5), PAstV3 (1), PAstV4 (8), PAstV5 (2), PKoV (3), PToV (1) y VDEP (4).
PAstV
SE DETECTARON CUATRO ESPECIES DE PAstV (PAstV2 A PAstV5), SIENDO PAstV4 Y PAstV2 LAS MÁS REPRESENTADAS
Las identidades nucleotídicas entre las secuencias de las cepas PAstV2 y PAstV4 recuperadas en nuestra investigación fueron del 77,2-95,2% y 87,2-93,7% respectivamente, mientras que su comparación con secuencias previamente descritas mostró identidades nucleotídicas del 68,7-91,0% para PAstV2, 87,6- 89,1% para PAstV3, 73,4-91,8% para PAstV4 y 83,3-94,4% para PAstV5.
La mayoría de las secuencias españolas de PAstV se agruparon con cepas norteamericanas del mismo linaje, aunque PAstV4 se agrupó con secuencias de Japón y algunas de PAstV2 con secuencias de Europa y China (Figura 5).
PKoV
En cuanto al análisis filogenético de PKoV (Figura 6), las tres secuencias obtenidas en este estudio se agruparon con otros aislados españoles y húngaros descritos con anterioridad.
La identidad nucleotídica fue del 90,3-91,4% entre los aislados españoles identificados en este estudio y del 87,2-91,9% con las secuencias del genoma completo del PKoV previamente descritas.
PToV
Se obtuvo un único genoma completo de PToV y, cuando se comparó con PToV descritos previamente, su identidad nucleotídica fue del 88,6-94,1%, mientras que cuando se comparó con secuencias de Torovirus de otras especies animales fue del 77,3-87,9%.
Esta secuencia española de PToV se agrupó con secuencias virales de Europa, en particular de Alemania, pero también con secuencias de EE.UU. y Japón (Figura 7).
DISCUSIÓN
El papel enteropatógeno de PAstV, PKoV, PToV, MRV y PAdV sigue siendo controvertido y los estudios de casos y controles que han comparado las ratios de detección en cerdos con diarrea y en cerdos sanos no han logrado, por el momento, clarificar esta cuestión39,46-50.
PREVALENCIAS
En este estudio nos planteamos como objetivo determinar, como punto de partida, la prevalencia de estas especies víricas entéricas en brotes de diarrea de diferentes edades y estudiar su asociación con enteropatógenos víricos bien reconocidos como los CoV (VDEP, VGET y SeCoV) y los RV (RVA y RVC).
Aunque el diseño del estudio no permite extraer conclusiones sobre el papel de estos virus en la etiología de la enfermedad entérica, pretende aumentar los conocimientos sobre su frecuencia, distribución y coinfecciones en granjas con problemas entéricos.
NUESTROS RESULTADOS CONFIRMAN QUE LAS INFECCIONES POR PAstV Y PKoV SON ALTAMENTE PREVALENTES EN LAS GRANJAS PORCINAS EUROPEAS, TAL Y COMO HABÍAN DESCRITO VARIOS ESTUDIOS19,46,49,50,56
Así, el PAstV fue el virus entérico más frecuente en nuestra investigación, detectado en casi la mitad de los brotes, seguido del PKoV, detectado en más del 25% de las granjas investigadas.
En concordancia con un informe previo en Hungría49, el PAdV fue menos frecuente (14,1% de los brotes positivos) mientras que el PToV solo se identificó en el 11,2% de las granjas investigadas, en contraposición a la amplia distribución de este virus evidenciada por otro estudio español que estimó más del 99% de animales seropositivos entre los cerdos de más de 11 semanas de edad57.
Por último, el MRV se detectó con menor frecuencia (4,4%), no existiendo datos previos sobre su prevalencia en las explotaciones porcinas europeas.
En cuanto a los CoVpodemos destacar que no se detectaron ni el VGET ni el SeCoV, identificándose el VDEP en el 19,9% de los brotes de diarrea investigados. Finalmente, la prevalencia de brotes positivos a RVA y RVC fue del 13,6 y el 6,3%, respectivamente.
DISTRIBUCIÓN POR EDADES
Se observaron tres patrones de distribución por edades entre los virus entéricos investigados.
Al igual que en estudios previos realizados en China16,47, Canadá44 y varios países europeos38,49,50, los PKoVfueron más prevalentes en animales jóvenes, lechones lactantes y postdestete, en comparación con las fases de engorde.
Se ha descrito una distribución similar para el RVC3, confirmándose en nuestro estudio, ya que no se produjo ningún brote positivo a RVC después del destete.
PAstV y RVA mostraron un aumento significativo de su prevalencia en cerdos destetados en comparación con cerdos lactantes.
Estudios previos en granjas porcinas europeas han informado de una tendencia similar para el PAstV46,49,50. Como se ha descrito para los RVA en granjas porcinas1, la disminución de anticuerpos maternales específicos podría explicar el aumento de la prevalencia del PAstV en el periodo postdestete.
Por último y, en consonancia con estudios anteriores28,49, PToV y PAdV se identificaron con mayor frecuencia en los brotes de diarrea durante el periodo de engorde.
ESTACIONALIDAD
Solo se demostró una distribución estacional para los brotes positivos de VDEP, que fueron más comunes durante los meses más fríos del año (enero-marzo).
Las bajas temperaturas que favorecen la supervivencia del CoV en el ambiente y facilitan la transmisión indirecta pueden explicar la variación estacional de los brotes de VDEP58,59. Además, se ha propuesto que la exposición a bajas temperaturas ambientales puede aumentar la replicación del VDEP a través de la regulación de la proteína de choque térmico Hsp70 en el intestino del cerdo, contribuyendo a la estacionalidad de este virus60.
NO SE HA DESCRITO ESTACIONALIDAD PARA LOS RV PORCINOS3
SOSPECHA DE ETIOLOGÍA VIRAL
Curiosamente, los criterios clínicos veterinarios que sugieren una presunta etiología viral se asociaron con la detección viral mediante análisis moleculares.
Esto fue particularmente evidente para los brotes positivos al VDEP, pero también para PAdV y en menor medida para PAstV, PToV o MRV. Por el contrario, RVA, RVC y PKoV se detectaron principalmente en brotes sin sospecha vírica.
El hecho de que las infecciones por RV sean endémicas en las poblaciones porcinas y se asocien con frecuencia a otros agentes productores de diarrea, como Escherichia coli enterotoxigénica o Clostridium perfringens tipo A3,61,62, podría complicar su reconocimiento por parte de los profesionales.
COINFECCIONES
Las coinfecciones fueron relativamente frecuentes, detectándose dos o más virus en casi el 40% de los brotes investigados.
Este resultado está en consonancia con estudios anteriores realizados en granjas porcinas europeas16,49,63 en los que se señalaba una elevada frecuencia de coinfecciones con varios virus entéricos en cerdos con diarrea.
En concordancia con estudios anteriores realizados en Europa49, China4,47 o Canadá44, el número de especies víricas diferentes detectadas en un brote aumenta con la edad de los cerdos afectados.
LAS INFECCIONES SIMPLES FUERON MÁS FRECUENTES EN LECHONES LACTANTES, MIENTRAS QUE EN CERDOS POSTDESTETE Y DE ENGORDE SE OBSERVARON COINFECCIONES SIMULTÁNEAS CON HASTA CINCO VIRUS
Muchos factores asociados al destete, como los cambios en la dieta, la colocación en un entorno nuevo y más contaminado, la mezcla de cerdos o la pérdida de inmunidad pasiva, pueden favorecer la infección por diferentes especies víricas. Además, se ha propuesto que la maduración del sistema inmunitario asociado al intestino tras el destete puede prevenir el desarrollo de enfermedades entéricas asociadas a infecciones simples para aquellos virus entéricos con una enteropatogenicidad moderada64.
Las coinfecciones que implicaban a PKoV fueron las más prevalentes en lechones lactantes (27,2%).
Recientemente, se ha propuesto que el VDEP y el PKoV podrían desempeñar algún papel sinérgico65, pero en nuestra investigación no se observó ninguna asociación significativa entre ambos virus.
El hecho de que la mayoría de los brotes de VDEP se produjeran en cerdos postdestete o de engorde, cuando el PKoV es menos prevalente, puede explicar este resultado.
Las coinfecciones con PAstV predominaron en los brotes posteriores al destete y en el engorde (87,4% y 60,6%, respectivamente).
La excreción de PToV fue más frecuente en los brotes positivos al VDEP y RVA.
Disponemos de muy poca información sobre las infecciones por PToV, pero merece la pena mencionar que el primer informe de PToV en Estados Unidos fue en un cerdo positivo a VDEP66. Además, observamos un aumento de la prevalencia de eliminadores de PAstV en brotes positivos a RVA.
SON NECESARIAS MÁS INVESTIGACIONES PARA DESCIFRAR LAS INTERACCIONES ENTRE LOS VIRUS ENTÉRICOS QUE PUEDEN DESEMPEÑAR UN PAPEL PRIMARIO O SECUNDARIO EN LA ETIOLOGÍA DE LA ENFERMEDAD ENTÉRICA EN CERDOS
Cabe señalar que los enfoques cuantitativos basados en la PCR cuantitativa (qPCR) y la secuenciación de nueva generación (NGS), que permiten estimar la carga viral, podrían aportar información adicional relevante en la investigación de la etiología de infecciones entéricas del ganado porcino.
Como proponen Cortey y colaboradores63, la determinación de la abundancia relativa de las distintas especies virales en las coinfecciones permite identificar el virus predominante que, con toda probabilidad, puede proponerse como agente etiológico primario.
ANÁLISIS FILOGENÉTICO
Por último, el análisis filogenético reveló que la mayoría de las cepas de PAstV se clasificaban como PAstV4 (50,0%, 8/16) yPAstV2(31,2%, 5/16), siendo estas dos especies las más prevalentes en cerdos con diarrea en España, de forma similar a lo descrito en varios países europeos46,50,67, en Norteamérica68 y en Asia39,69,70.
Los análisis filogenéticos de PKoVrevelaron que todas las secuencias completas españolas disponibles (incluidas las tres identificadas en nuestro estudio) estaban incluidas en un único clúster local junto con una cepa húngara y bien diferenciadas de otros aislados europeos38, mientras que la única secuencia completa del genoma de PToVobtenida en esta investigación se agrupó junto con otros aislados de PToV de Europa, América o Asia25,26.
CONCLUSIONES
A pesar de que el diseño de este estudio no permitió evaluar el papel de PAstV, PKoV, PToV, MRV o PAdV como agentes causales de diarrea en cerdos, demuestra una alta prevalencia de estos virus entéricos en los brotes de diarrea, particularmente para PAstV y PKoV, detectados en casi el 50% y el 30% de las granjas investigadas.
El hecho de que estos virus entéricos estén frecuentemente implicados en coinfecciones entre ellos y con enteropatógenos virales bien reconocidos, como CoV o RV, hace necesarios estudios adicionales de vigilancia y caracterización, así como investigaciones para evaluar su potencial patogénico tanto en infecciones experimentales como naturales.
Una vez que se disponga de estos estudios, deberá considerarse la inclusión de estos virus en los paneles de diagnóstico de rutina para la diarrea en cerdos.
1. Thomson JR, Friendship RM. Digestive System. In: Zimmerman JJ, Karriker LA, Ramirez A, Schwartz K, Stevenson GW, Zhang J, editors. Dis swine. 11th ed. Hoboken: John Wiley & Sons; 2019. p. 234–63.
2. Pensaert MB, Martelli P. Porcine epidemic diarrhea: A retrospect from Europe and matters of debate. Virus Res. 2016;226:1–6.
3. Vlasova AN, Amimo JO, Saif LJ. Porcine rotaviruses: Epidemiology, immune responses and control strategies. Viruses. 2017;9:1–27.
4. Zhang Q, Hu R, Tang X, Wu C, He Q, Zhao Z, et al. Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China. Arch Virol. 2013;158:1631–6.
5. Wang Q, Vlasova AN, Kenney SP, Saif LJ. Emerging and re-emerging coronaviruses in pigs. Curr Opin Virol. 2019;34:39–49.
6. Jung K, Saif LJ, Wang Q. Porcine epidemic diarrhea virus (VDEP): An update on etiology, transmission, pathogenesis, and prevention and control. Virus Res. 2020;286.
7. Boniotti MB, Papetti A, Lavazza A, Alborali G, Sozzi E, Chiapponi C, et al. Porcine epidemic diarrhea virus and discovery of a recombinant swine enteric coronavirus, Italy. Emerg Infect Dis. 2016;22:83–7.
8. de Nova PJG, Cortey M, Díaz I, Puente H, Rubio P, Martín M, et al. A retrospective study of porcine epidemic diarrhoea virus (VDEP) reveals the presence of swine enteric coronavirus (SeCoV) since 1993 and the recent introduction of a recombinant VDEP-Se-CoV in Spain. Transbound Emerg Dis. 2020;67:2911–2922.
9. Belsham GJ, Rasmussen TB, Normann P, Vaclavek P, Strandbygaard B, Bøtner A. Characterization of a Novel Chimeric Swine Enteric Coronavirus from Diseased Pigs in Central Eastern Europe in 2016. Transbound Emerg Dis. 2016;63:595–601.
10. Akimkin V, Beer M, Blome S, Hanke D, Höper D, Jenckel M, et al. New chimeric porcine coronavirus in Swine Feces, Germany, 2012. Emerg Infect Dis. 2016;22:1314–5.
11. Puente H, Díaz I, Arguello H, Mencía-Ares Ó, Gómez-García M, Pérez-Pérez L, et al. Characterization and cross protection of experimental infections with SeCoV and two VDEP variants. Transbound Emerg Dis. 2022;1–13.
12. Woo PCY, Lau SKP, Lam CSF, Lau CCY, Tsang AKL, Lau JHN, et al. Discovery of Seven Novel Mammalian and Avian Coronaviruses in the Genus Deltacoronavirus Supports Bat Coronaviruses as the Gene Source of Alphacoronavirus and Betacoronavirus and Avian Coronaviruses as the Gene Source of Gammacoronavirus and Deltacoronavi. J Virol. 2012;86:3995–4008.
13. Gong L, Li J, Zhou Q, Xu Z, Chen L, Zhang Y, et al. A new bat-HKU2–like coronavirus in swine, China, 2017. Emerg Infect Dis. 2017;23:1607–9.
14. Pan Y, Tian X, Qin P, Wang B, Zhao P, Yang Y-L, et al. Discovery of a novel swine enteric alphacoronavirus (SeACoV) in southern China. Vet Microbiol. Elsevier; 2017;211:15–21.
15. Bhatta TR, Chamings A, Alexandersen S. Exploring the cause of diarrhoea and poor growth in 8–11-week-old pigs from an australian pig herd using metagenomic sequencing. Viruses. 2021;13.
16. Capai L, Piorkowski G, Maestrini O, Casabianca F, Masse S, de Lamballerie X, et al. Detection of porcine enteric viruses (Kobuvirus, Mamastrovirus and Sapelovirus) in domestic pigs in Corsica, France. PLoS One. 2022;17:1–15.
17. Flores C, Ariyama N, Bennett B, Mena J, Verdugo C, Mor S, et al. Case Report: First Report and Phylogenetic Analysis of Porcine Astroviruses in Chile. Front Vet Sci. 2021;8.
18. Rawal G, Linhares DCL. Scoping review on the epidemiology, diagnostics and clinical significance of porcine astroviruses. Transbound Emerg Dis. 2022;69:974–85.
19. Stamelou E, Giantsis IA, Papageorgiou K V., Petridou E, Davidson I, Polizopoulou ZS, et al. Epidemiology of Astrovirus, Norovirus and Sapovirus in Greek pig farms indicates high prevalence of Mamastrovirus suggesting the potential need for systematic surveillance. Porc Heal Manag. BioMed Central; 2022;8:1–15.
20. Tassoni L, Zamperin G, Schiavon E, Vendramin V, Cavicchio L, Mion M, et al. First whole genome characterization of porcine astrovirus detected in swine faeces in Italy. Vet Ital. 2019;55:221–9.
21. Akagami M, Ito M, Niira K, Kuroda M, Masuda T, Haga K, et al. Complete genome analysis of porcine kobuviruses from the feces of pigs in Japan. Virus Genes. Springer US; 2017;53:593–602.
22. Nantel-Fortier N, Lachapelle V, Letellier A, L’Homme Y, Brassard J. Kobuvirus shedding dynamics in a swine production system and their association with diarrhea. Vet Microbiol. Elsevier; 2019;235:319–26.
23. Milićević V, Kureljušić B, Maksimović-Zorić J, Savić B, Spalević L, Žutić J. Molecular detection and characterization of Porcine Kobuvirus in domestic pigs and wild boars in Serbia. Res Vet Sci. 2020;132:404–6.
24. Zhai SL, Zhang H, Lin T, Chen SN, Zhou X, Chen QL, et al. A novel porcine kobuvirus emerged in piglets with severe diarrhoea in China. Transbound Emerg Dis. 2017;64:1030–6.
25. Hu ZM, Yang Y Le, Xu LD, Wang B, Qin P, Huang YW. Porcine Torovirus (PToV)-A brief review of etiology, diagnostic assays and current epidemiology. Front Vet Sci. 2019;6:1–6.
26. Fujii Y, Kashima Y, Sunaga F, Aoki H, Imai R, Sano K, et al. Complete genome sequencing and genetic analysis of a Japanese porcine torovirus strain detected in swine feces. Arch Virol. Springer Vienna; 2020;165:471–7.
27. Shin DJ, Park SI, Jeong YJ, Hosmillo M, Kim HH, Kim HJ, et al. Detection and molecular characterization of porcine toroviruses in Korea. Arch Virol. 2010;155:417–22.
28. Pignatelli J, Jiménez M, Grau-Roma L, Rodríguez D. Detection of porcine torovirus by real time RT-PCR in piglets from a Spanish farm. J Virol Methods. 2010;163:398–404.
29. Zhou L, Wei H, Zhou Y, Xu Z, Zhu L, Horne J. Molecular epidemiology of Porcine torovirus (PToV) in Sichuan Province, China: 2011-2013. Virol J. 2014;11:1–9.
30. Qin P, Li H, Wang J, Wang B, Xie R, Xu H, et al. Genetic and pathogenic characterization of a novel reassortant mammalian orthoreovirus 3 (MRV3) from a diarrheic piglet and seroepidemiological survey of MRV3 in diarrheic pigs from east China Pan. Vet Microbiol. 2017;208:126–36.
31. Singh F, Rajukumar K, Senthilkumar D, Venkatesh G, Srivastava D, Kombiah S, et al. First report on co-isolation and whole-genomic characterisation of mammalian orthorubulavirus 5 and mammalian orthoreovirus type 3 from domestic pigs in India. Arch Virol. Springer Vienna; 2022;167:1529–45.
32. Day JM. The diversity of the orthoreoviruses: Molecular taxonomy and phylogentic divides. Infect Genet Evol. 2009;9:390–400.
33. Luo Y, Fei L, Yue H, Li S, Ma H, Tang C. Prevalence and genomic characteristics of a novel reassortment mammalian orthoreovirus type 2 in diarrhea piglets in Sichuan, China. Infect Genet Evol. Elsevier; 2020;85:104420.
34. Lelli D, Beato MS, Cavicchio L, Lavazza A, Chiapponi C, Leopardi S, et al. First identification of mammalian orthoreovirus type 3 in diarrheic pigs in Europe. Virol J. Virology Journal; 2016;13:1–5.
35. Kumthip K, Khamrin P, Kongkaew A, Vachirachewin R, Malasao R, Ushijima H, et al. Molecular epidemiology and characterization of porcine adenoviruses in pigs with diarrhea in Thailand. Infect Genet Evol. Elsevier; 2019;67:73–7.
36. De Motes CM, Clemente-Casares P, Hundesa A, Martín M, Girones R. Detection of Bovine and Porcine Adenoviruses for Tracing the Source of Fecal Contamination. Appl Environ Microbiol. 2004;70:1448–54.
37. Buitrago D, Cano-Gómez C, Agüero M, Fernandez-Pacheco P, Gómez-Tejedor C, Jiménez-Clavero MÁ. A survey of porcine picornaviruses and adenoviruses in fecal samples in Spain. J Vet Diagnostic Investig. 2010;22:763–6.
38. Jackova A, Sliz I, Mandelik R, Salamunova S, Novotny J, Kolesarova M, et al. Porcine kobuvirus 1 in healthy and diarrheic pigs: Genetic detection and characterization of virus and co-infection with rotavirus A. Infect Genet Evol. The Authors; 2017;49:73–7.
39. Kumthip K, Khamrin P, Saikruang W, Kongkaew A, Vachirachewin R, Ushijima H, et al. Detection and genetic characterization of porcine astroviruses in piglets with and without diarrhea in Thailand. Arch Virol. Springer Vienna; 2018;163:1823–9.
40. Zhou Y, Chen L, Zhu L, Xu Z. Molecular detection of porcine torovirus in piglets with diarrhea in southwest China. Sci World J. 2013;2013.
41. Kwon HJ, Kim HH, Kim HJ, Park JG, Son KY, Jung J, et al. Detection and molecular chracterization of porcine type 3 orthoreoviruses circulating in South Korea. Vet Microbiol. 2012;157:456–63.
42. Gunn L, Collins PJ, Fanning S, McKillen J, Morgan J, Staines A, et al. Detection and characterisation of novel bocavirus (genus Bocaparvovirus) and gastroenteritis viruses from asymptomatic pigs in Ireland. African J Disabil. 2015;5.
43. García-Hernández M-E, Trujillo-Ortega M-E, Alcaraz-Estrada S-L, Lozano-Aguirre- Beltrán L, Sandoval-Jaime C, Taboada-Ramírez BI, et al. Molecular Detection and Characterization of Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine Aichivirus C Coinfection in México. Viruses. 2021;13:738.
44. Nantel-Fortier N, Gauthier M, L’Homme Y, Lachapelle V, Fravalo P, Brassard J. The swine enteric virome in a commercial production system and its association with neonatal diarrhea. Vet Microbiol. Elsevier B.V.; 2022;266:109366.
45. Su M, Qi S, Yang D, Guo D, Yin B, Sun D. Coinfection and Genetic Characterization of Porcine Astrovirus in Diarrheic Piglets in China From 2015 to 2018. Front Vet Sci. 2020;7:3–6.
46. Salamunova S, Jackova A, Mandelik R, Novotny J, Vlasakova M, Vilcek S. Molecular detection of enteric viruses and the genetic characterization of porcine astroviruses and sapoviruses in domestic pigs from Slovakian farms. BMC Vet Res. BMC Veterinary Research; 2018;14:1–9.
47. Werid GM, Ibrahim YM, Chen H, Fu L, Wang Y. Molecular Detection and Genetic Characterization of Potential Zoonotic Swine Enteric Viruses in Northern China. Pathogens. 2022;11:28–30.
48. Chuchaona W, Khamrin P, Yodmeeklin A, Kongkaew A, Vachirachewin R, Kumthip K, et al. Detection and molecular characterization of porcine kobuvirus in piglets in 2009–2013 in northern Thailand. Trop Anim Health Prod. Tropical Animal Health and Production; 2017;49:1077–80.
49. Valkó A, Marosi A, Cságola A, Farkas R, Rónai Z, Dán Á. Frequency of diarrhoea-associated viruses in swine of various ages in Hungary. Acta Vet Hung. 2019;67:140–50.
50. Zhou W, Ullman K, Chowdry V, Reining M, Benyeda Z, Baule C, et al. Molecular investigations on the prevalence and viral load of enteric viruses in pigs from five European countries. Vet Microbiol. 2016;182:75–81.
51. Ulloa JC, Olarte-Aponte AM, Ospina JC, Rincon MA. Experimental infection of conventional newly-weaned piglets with porcine astrovirus. Acta Virol. 2019;63:96–102.
52. Fang Q, Wang C, Liu H, Wu Q, Liang S, Cen M, et al. Pathogenic characteristics of a porcine astrovirus strain isolated in China. Viruses. 2019;11:1–17.
53. Thimmasandra Narayanappa A, Sooryanarain H, Deventhiran J, Cao D, Ammayappan Venkatachalam B, Kambiranda D, et al. A novel pathogenic Mammalian orthoreovirus from diarrheic pigs and Swine blood meal in the United States. MBio. American Society for Microbiology (ASM); 2015;6:e00593-15.
54. Ducatelle R, Coussement W, Hoorens J. Sequential Pathological Study of Experimental Porcine Adenovirus Enteritis. Vet Pathol. 1982;19:179–89.
55. McAdaragh J, Eustis S, Benfield D. Adenovirus associated with diarrhea in pigs. Conf Res Work Anim Dis. Chicago; 1980.
56. Goecke NB, Hjulsager CK, Kongsted H, Boye M, Rasmussen S, Granberg F, et al. No evidence of enteric viral involvement in the new neonatal porcine diarrhoea syndrome in Danish pigs. BMC Vet Res. BioMed Central; 2017;13:315.
57. Alonso-Padilla J, Pignatelli J, Simon-Grifé M, Plazuelo S, Casal J, Rodríguez D. Seroprevalence of porcine torovirus (PToV) in Spanish farms. BMC Res Notes. 2012;5.
58. Carvajal A, Argüello H, Martínez-Lobo FJ, Costillas S, Miranda R, de Nova PJG, et al. Porcine epidemic diarrhoea: New insights into an old disease. Porc Heal Manag. Porcine Health Management; 2015;1:1–8.
59. Dortmans JCFM, Li W, van der Wolf PJ, Buter GJ, Franssen PJM, van Schaik G, et al. Porcine epidemic diarrhea virus (VDEP) introduction into a naive Dutch pig population in 2014. Vet Microbiol. 2018;221:13–8.
60. Kong F, Xu Y, Ran W, Yin B, Feng L, Sun D. Cold exposure-induced up-regulation of HSP70 positively regulates VDEP mRNA synthesis and protein expression in vitro. Pathogens. 2020;9.
61. Vidal A, Martín-valls GE, Tello M, Mateu E, Martín M. Prevalence of enteric pathogens in diarrheic and non diarrheic samples from pig farms with neonatal diarrhea in the North East of Spain. Vet Microbiol. 2019;237:108419.
62. Mesonero-Escuredo S, Strutzberg-Minder K, Casanovas C, Segalés J. Viral and bacterial investigations on the aetiology of recurrent pig neonatal diarrhoea cases in Spain. Porc Heal Manag. Porcine Health Management; 2018;4:1–6.
63. Cortey M, Díaz I, Vidal A, Martín-Valls G, Franzo G, Gómez De Nova PJ, et al. High levels of unreported intraspecific diversity among RNA viruses in faeces of neonatal piglets with diarrhoea. BMC Vet Res. BMC Veterinary Research; 2019;15:1–13.
64. Bauer E, Williams BA, Smidt H, Verstegen MWA, Mosenthin R. Influence of the gastrointestinal microbiota on development of the immune system in young animals. Curr Issues Intest Microbiol. 2006;7:35–52.
65. Qiu M, Li S, Xiao Y, Li J, Zhang Y, Li X, et al. Pathogenic and metagenomic evaluations reveal the correlations of porcine epidemic diarrhea virus, porcine kobuvirus and porcine astroviruses with neonatal piglet diarrhea. Microb Pathog. Elsevier Ltd; 2022;170:105703.
66. Anbalagan S, Peterson J, Wassman B, Elston J, Schwartz K. Genome sequence of torovirus identified from a pig with porcine epidemic diarrhea virus from the United States. Genome Announc. 2014;2:3–4.
67. Dufkova L, Scigalkova I, Moutelikova R, Malenovska H, Prodelalova J. Genetic diversity of porcine sapoviruses, kobuviruses, and astroviruses in asymptomatic pigs: An emerging new sapovirus GIII genotype. Arch Virol. 2013;158:549–58.
68. Mor SK, Chander Y, Marthaler D, Patnayak DP, Goyal SM. Detection and molecular characterization of Porcine astrovirus strains associated with swine diarrhea. J Vet Diagnostic Investig. 2012;24:1064–7.
69. Cai Y, Yin W, Zhou Y, Li B, Ai L, Pan M, et al. Molecular detection of Porcine astrovirus in Sichuan Province, China. Virol J. 2016;13:1–5.
70. Lee MH, Jeoung HY, Park HR, Lim JA, Song JY, An DJ. Phylogenetic analysis of porcine astrovirus in domestic pigs and wild boars in South Korea. Virus Genes. 2013;46:175–81.
71. Tamura K, Stecher G, Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol Biol Evol. 2021;38:3022–7.
72. Liu Q, Wang HY. Porcine enteric coronaviruses: an updated overview of the pathogenesis, prevalence, and diagnosis. Vet Res Commun. Springer Netherlands; 2021;45:75–86.
73. Saif LJ, Wang Q, Vlasova AN, Jung K, Xiao S. Coronaviruses. In: Zimmerman JJ, Karriker LA, Ramirez A, Schwartz KJ, Stevenson GW, Zhang J, editors. Dis swine. 11th ed. Hoboken: John Wiley and Sons; 2019. p. 488–523.
74. Li C, Lu H, Geng C, Yang K, Liu W, Liu Z, et al. Epidemic and Evolutionary Characteristics of Swine Enteric Viruses in South Central China from 2018 to 2021. Viruses. 2022;14.
75. Wang L, Byrum B, Zhang Y. Detection and genetic characterization of deltacoronavirus in pigs, Ohio, USA, 2014. Emerg Infect Dis. Centers for Disease Control and Prevention; 2014;20:1227–30.
76. Kong F, Wang Q, Kenney SP, Jung K, Vlasova AN, Saif LJ. Porcine Deltacoronaviruses: Origin, Evolution, Cross Species Transmission and Zoonotic Potential. Pathogens. 2022;11:1–17.
77. Xu Z, Zhang Y, Gong L, Huang L, Lin Y, Qin J, et al. Isolation and characterization of a highly pathogenic strain of Porcine enteric alphacoronavirus causing watery diarrhoea and high mortality in newborn piglets. Transbound Emerg Dis. 2018;66:119–30.
78. Fu X, Fang B, Liu Y, Cai M, Jun J, Ma J, et al. Newly emerged porcine enteric alphacoronavirus in southern China: Identification, origin and evolutionary history analysis. Infect Genet Evol. Elsevier; 2018;62:179–87.
79. Zhou P, Fan H, Lan T, Yang X Lou, Shi WF, Zhang W, et al. Fatal swine acute diarrhoea syndrome caused by an HKU2-related coronavirus of bat origin. Nature. 2018;556:255–9.
80. Marthaler D, Homwong N, Rossow K, Culhane M, Goyal S, Collins J, et al. Rapid detection and high occurrence of porcine rotavirus A, B, and C by RT-qPCR in diagnostic samples. J Virol Methods. Elsevier B.V.; 2014;209:30–4.
81. Wu FT, Liu LTC, Jiang B, Kuo TY, Wu CY, Liao MH. Prevalence and diversity of rotavirus A in pigs: Evidence for a possible reservoir in human infection. Infect Genet Evol. Elsevier B.V.; 2022;98:105198.
82. Chepngeno J, Takanashi S, Diaz A, Michael H, Paim FC, Rahe MC, et al. Comparative Sequence Analysis of Historic and Current Porcine Rotavirus C Strains and Their Pathogenesis in 3-Day-Old and 3-Week-Old Piglets. Front Microbiol. 2020;11:1–13.
83. Qin P, Li H, Wang JW, Wang B, Xie RH, Xu H, et al. Genetic and pathogenic characterization of a novel reassortant mammalian orthoreovirus 3 (MRV3) from a diarrheic piglet and seroepidemiological survey of MRV3 in diarrheic pigs from east China. Vet Microbiol. 2017;208:126–36.
