La diarrea postdestete (DPD) conlleva una alta morbilidad y mortalidad en los lechones destetados y es una de las principales causas del uso de antimicrobianos en todo el mundo. Con la entrada en vigor de las nuevas normativas de la UE que limitan el uso de antibióticos (Ab) y óxido de zinc (ZnO) para prevenir la diarrea postdestete, es necesario encontrar nuevos enfoques para controlar la enfermedad y entender el papel de la microbiota. En este estudio, se realizó una secuenciación del metagenoma para describir la evolución taxonómica y funcional de la microbiota fecal del lechón durante las dos primeras semanas postdestete en tres grupos experimentales (Ab, ZnO y control sin medicación) en granjas comerciales que utilizan antimicrobianos de forma regular durante el postdestete.
LA VIDA SECRETA DE LA MICROBIOTA INTESTINAL PORCINA POSTDESTETE
En la última década, los estudios de secuenciación de alto rendimiento han revolucionado los conocimientos sobre las comunidades microbianas, especialmente en el intestino1. Numerosos estudios describen con detalle la evolución de la microbiota porcina, a nivel taxonómico de género2,3 y especie4, a lo largo de su ciclo productivo, poniendo de manifiesto la alteración repentina de la microbiota en lechones destetados en condiciones comerciales intensivas5,6.
La disbiosis de la microbiota que se produce en el momento del destete es uno de los principales factores desencadenantes de la DPD, el problema sanitario más frecuente en las explotaciones porcinas comerciales y una de los principales motivos de uso de antimicrobianos7.
Este proceso suele estar asociado a Escherichia coli, principalmente a cepas de E. coli enterotoxigénica (ETEC), pero también a otros patógenos como cepas enteroadherentes de E. coli, Salmonella enterica, Lawsonia intracellularis o Rotavirus.
Durante más de cinco décadas, el control de la DPD se ha abordado mediante el uso sistemático de antibióticos y aditivos como el ZnO5,7-9 que tienen un efecto antimicrobiano sobre los patógenos diana, pero que también pueden afectar a la microbiota de los lechones al destete10-13, modificando así su composición14. Sin embargo, hasta la fecha ha sido difícil identificar cambios comunes en la microbiota en distintas explotaciones o estudios.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA MICROBIOTA DELECHONES DESTETADOS
DISEÑO EXPERIMENTAL
Durante el estudio se evaluó en cuatro granjas en las que se utilizaban regularmente antibióticos y ZnO en el periodo postdestete el efecto de tres tratamientos dietéticos diferentes:
Grupo Ab: pienso control + antibiótico (Granjas A, B y C: 250 mg/kg de sulfadiazina + 50 mg/kg de trimetoprima; Granja D: 400 mg/kg de amoxicilina).
Grupo ZnO: pienso control + ZnO (2.500 mg/kg de ZnO).
Grupo Ct: pienso control no medicado.
Los tratamientos dietéticos se administraron durante las dos primeras semanas postdestete y se tomaron muestras los 0, 7 y 14 días postdestete (dpw), replicándose el experimento dos veces en las cuatro granjas.
En los días de muestreo 0, 7 y 14 dpw, se obtuvieron al azar tres muestras de heces recientes de 3 lechones/corral de tratamiento y se mezclaron y homogeneizaron en un vaso de 100 ml.
FIGURA 1: Cronograma de los tratamientos dietéticos (Ab, ZnO y Ct) realizados en las granjas A, B, C y D durante las 2 semanas postdestete y la obtención de muestras fecales.
RESULTADOS
LA DIVERSIDAD Y LA RIQUEZA MICROBIANAS DEPENDEN DEL DÍA POSTDESTETE, TRATAMIENTO Y APARICIÓN DE DIARREA
DIVERSIDAD α
El análisis de la diversidad α (diversidad de especies dentro de una comunidad microbiana) se realizó estimando índices de riqueza y homogeneidad (Gráfica 1).
La diversidad disminuyó durante [registrados]el periodo postdestete para todos los índices a nivel de especie (Gráfica 1A) y funcional (Gráfica 1C).
Los tratamientos no afectaron a la diversidad a nivel de especie (Gráfica 1B) pero sí a la diversidad funcional a los 7 y 14 dpw (Gráfica 1D) en los animales del grupo ZnO.
Al comparar la diversidad α en muestras fecales normales y diarreicas obtenidas a los 7 dpw, a nivel de especie, las heces diarreicas presentaron menor diversidad en el grupo Ct (Gráfica 1E), mientras que, a nivel funcional, mostraron una mayor diversidad en comparación con las heces diarreicas.
GRÁFICA 1: Análisis de la diversidad α de la microbiota a nivel de especies y funcional, por dpw y tratamiento. (A) Diversidad α a nivel de especie, según el dpw (A), según el tratamiento a nivel de especie (B), a nivel funcional (categoría SF3) por dpw (C). Diversidad α por tratamiento entre cada dpw, realizado a nivel funcional (categoría SF3) (D). Diversidad α en muestras del dpw 7, comparando heces normales y diarreicas y realizado a nivel funcional (categoría SF3) en cada grupo de tratamiento dietético (E). *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001.
DIVERSIDAD β
En lo que respecta a la diversidad β (diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre individuos), la ordenación de las muestras en un escalado multidimensional no métrico (NMDS) (Gráfica 2) reveló diferencias en la composición de la microbiota según el tratamiento, el dpw y la consistencia fecal, tanto a nivel de especie (Gráfica 2A y B) como funcional (Gráfica 2C).
A nivel global, el análisis en función del tratamiento y dpw reveló diferencias en la composición de la microbiota en función del dpw, pero no en función del tratamiento.
Se llevaron a cabo análisis en base al tratamiento para cada muestreo, observándose cambios a nivel taxonómico a los 14 dpw en el grupo Zn en comparación con los grupos Ab y Ct , así como cambios a nivel funcional en el grupo Zn con respecto al grupo Ct.
GRÁFICA 2: Análisis de la diversidad β de la microbiota en función del tipo de muestra (consistencia), el dpw y tratamiento. (A-C) Ordenación de muestras a nivel de especie (A-B) y funcional (C) en un NMDS, coloreado según la consistencia fecal y el factor dpw (Consistencia-dpw). (A) Las flechas muestran las 15 especies con la abundancia media más alta (las flechas muestran las especies significativas; la longitud de las flechas muestra la fuerza de cada especie para influir en la ordenación de las muestras). Las especies ajustadas a la ordenación se indican como números, ordenados según sus coordenadas NMDS. 1: Oscillibacter sp. PEA192, 2: Bacteria clostridial CCNA10, 3: Escherichia coli, 4: Megasphaera elsdenii, 5: Limosilactobacillus reuteri, 6: Anaerobutyricumhallii, 7: Faecalibacteriumprausnitzii, 8: Roseburia hominis, 9: Limosilactobacillus reuteri: Roseburia hominis, 9: Prevotella ruminicola, 10: Eubacterium rectale, 11: Prevotella dentalis, 12: Hoylesella enoeca, 13: Prevotella oris, 14: Blautia pseudococcoides, 15: Bacteria Lachnospiraceae GAM79. (B) Agrupación de Ward de las distancias de Bray Curtis en un NMDS. El dendrograma se divide en cuatro ramas y se colorea según la disposición de las muestras en el espacio NMDS. C) Ordenación de las muestras mediante distancias de Bray-Curtis a nivel funcional de la categoría SF3. (D) Ordenación de muestras de diarrea del dpw 7 en un NMDS, coloreado por tratamiento tanto a nivel de especie (superior) como funcional (inferior). (E) Ordenación de muestras fecales del dpw 14 en un NMDS, coloreado por tratamiento tanto a nivel de especie (superior) como funcional (inferior). Las elipses representan la covarianza para cada nivel de factor: consistencia fecal y dpw en las Gráficas A-C; y tratamiento en las Gráficas D-E. El factor granja viene indicado por la forma de los puntos en las Gráficas B-E, coloreados según la consistencia fecal y dpw (B-C) o el tratamiento (D-E).
EL DESTETE Y LA APARICIÓN DE DIARREA DEFINEN LOS PRINCIPALES GRUPOS TAXONÓMICOS
El análisis posterior de los grupos de muestras y de las especies representativas en las mismas permitió identificar cuatro clústeres (Gráfica 3).
CLÚSTER 1 (muestras de todos los puntos temporales y tratamientos):
Collinsella aerofaciens
Faecalibacterium prausnitzii
CLÚSTER 2 (muestras de los días postdestete 7 y 14):
Prevotella spp.
Orden Eubacteriales (Anaerobutyricum hallii, Anaerostipes hadrus, Lachnospiraceae GAM79, Lachnospira eligens y Roseburia hominis).
CLÚSTER 3 (muestras del día 0 postdestete, 13/16 muestras)
Ruminococcus spp.
Blautia spp.
Oscillibacter spp.
Lachnoclostridium spp.
Bacteroides cellulosilyticus
Clostridiales CCNA10
Clostridioides difficile
Lacrimispora saccharolytica
Clostridium sp. SY8519
Intestinimonas butyriciproducens
Flavonifractor plautii
Hungateiclostridiaceae KB18
Lachnospiraceae Choco86
Massilistercora timonensis
Phascolarctobacterium faecium
CLÚSTER 4 (mayoría de muestras de diarrea del día 7 postdestete -8-, 2 muestras del día 7 postdestete y 5 del día 0 postdestete):
Bacteroides fragilis
Phocaeicola vulgatus
Escherichia coli
GRÁFICA 3: Abundancia relativa de las principales especies en cada muestra. El dendrograma de clústeres representa la similitud entre muestras en cuanto a su composición microbiana. La información sobre las variables de cada muestra (de nivel inferior a superior: Granja, Tratamiento, Consistencia-dpw) se indica en los cuadrados coloreados debajo de las barras. Los números al lado de cada rama se refieren a los grupos principales definidos por la agrupación de Ward, para los cuales las especies indicadoras de cada grupo determinadas por ‘multipatt’ se muestran en la parte inferior.
LA COMPOSICIÓN MICROBIANA EVOLUCIONA RÁPIDAMENTE DURANTE EL POSTDESTETE Y SE VE AFECTADA POR LOS TRATAMIENTOS Y LA DIARREA
Con el fin de comparar la evolución de la microbiota a lo largo de las dos semanas postdestete en relación a cada tratamiento, se estudiaron por separado losperfiles de abundancia relativa media de las especies en cada nivel de consistencia – dpw (Gráfica 4A).
En las muestras no diarreicas, F. prausnitziifue la especie dominante, independientemente del factor dpw.
Las muestras del dpw 0 presentaron unas pocas especies dominantes como E. coli, F. prausnitzii, Oscillibacter spp. y Clostridiales CCNA10.
La abundancia relativa de algunos grupos se vio afectada a la semana postdestete (Fecal_7dpw), observándose un aumento de la abundancia de Prevotella spp., Lachnospiraceae GAM79y L. reuteri, así como una disminución de la abundancia de Intestinimonas butyriciproducens y Oscillibacter spp. en el grupo Ct (Gráfica 4A).
En los grupos Ab y ZnO se detectaron por primera vez especies como Eubacterium rectale o Prevotella intermedia.
Se observó un aumento de la abundancia de Megasphaera elsdenii en el grupo Ab a los 7 y 14 dpw.
La abundancia relativa de L. reuteri y L. amylovorus se vio afectada por el tratamiento con ZnO, con una menor abundancia durante las dos semanas del estudio.
Se observó una menor abundancia o ausencia de E. coli en los grupos Ab y ZnO en las muestras de a los 7 y 14 dpw.
Otras bacterias afectadas por los tratamientos en las muestras diarreicas fueron L. GAM79, que estuvo ausente en las muestras Ct y mantuvo una abundancia relativa similar en los grupos de tratamiento Ab y ZnO.
Las especies observadas únicamente en las muestras diarreicas relacionadas con la administración de ZnO fueron C. CCNA10 y P. vulgatus.
En la microbiota de las heces del dpw 14 hubo un predominio de Prevotella spp. (P. ruminicola, P. dentalis, H. enoeca y P. oris) en los grupos Ct y Ab mientras que estuvo ausente en el grupo ZnO.
Al comparar los perfiles de abundancia relativa media de cada nivel de consistencia-dpw entre explotaciones y tratamientos, se encontró una tendencia similar en el efecto inhibitorio del ZnO sobre el crecimiento de E. coli en las tres explotaciones en las que se observó diarrea.
Los datos funcionales agrupados en categorías de nivel SF1 (Gráfica 4B) revelaron que las categorías más abundantes en todas las muestras de consistencia-dpw:
Carbohidratos
Metabolismo proteico
Aminoácidos y derivados
Metabolismo del ADN
Cofactores, vitaminas, grupos prostéticos y pigmentos.
Entre ellas, estas funciones alcanzaron algo menos del 50% en las muestras diarreicas del día 7 postdestete en el grupo Ct, representando la categoría Virulencia el 4,45%, frente a un rango de 3,19-3,59% en el resto de las muestras.
GRÁFICA 4: Composición de la microbiota fecal de lechones destetados en los dpw 0, 7 y 14. (A). Abundancia relativa media de las especies más representativas en cada grupo de consistencia-dpw. (B) Abundancia relativa media de las categorías funcionales más representativas del nivel SF1 en cada grupo de consistencia-dpw. Los grupos de consistencia-dpw están divididos en función del tratamiento dietético.
LA ABUNDANCIA DIFERENCIAL DE LAS ESPECIES ESTÁ DEFINIDA POR LA RELACIÓN TRATAMIENTO-TIEMPO
El análisis de abundancia diferencial de especies mostró variaciones según el tratamiento y el tiempo (Gráfica 5A y B).
La comparación de los datos globales y en función de los factores de consistencia fecal y dpw reveló resultados distintos en cada subconjunto (Gráfica 5C, D y E).
El análisis global vinculó varias especies de la familia Selenomonadaceae al grupo Ct, mientras que los del grupo ZnO mostraron mayor abundancia relativa de bacterias como Bacteroides spp. y Clostridioidesdifficile(Gráfica 5A). A los 7 dpw (Gráfica 5C), las muestras del grupo Ct presentaron mayor abundancia de bacterias como Desulfovibrio piger y Ruminococcus spp., mientras que los animales del grupo Ab tuvieron mayor abundancia de Selenomonas sputigena y los del grupo ZnO mostraron mayor abundancia relativa de Selenomonas ruminantium y Clostridioides difficile. A los 14 días postdestete (Gráfica 5D), el grupo Ct se asoció con Megasphaera spp. y varias especies de Selenomonadaceae, mientras que el grupo ZnO tuvo una mayor abundancia de especies de Tanerellaceae y Bacteroidaceae. Las muestras diarreicas a los 7 dpw (Gráfica 5E) revelaron mayor abundancia de E. coli en el grupo Ct y mayor abundancia de Bacteroidaceae y lntestinimonas butyriciproducens en el grupo Zn.
GRÁFICA 5. Diferencias en la abundancia de especies, que explicarían las diferencias entre los tratamientos dietéticos. Las barras horizontales representan la importancia de la especie en las diferencias entre tratamientos. (A) Especies asociadas a cada tratamiento dietético en el análisis de datos globales de especies. (B) Taxones asociados a cada tratamiento dietético en el análisis de datos globales de especies. Las especies significativas están coloreadas según el tratamiento al que se asocian. (C) Especies asociadas a cada tratamiento dpw 7. (D) Especies asociadas a cada tratamiento el dpw 14. (E) Especies asociadas a cada tratamiento, en muestras de diarrea del dpw 7.
ABUNDANCIA DIFERENCIAL FUNCIONAL
Se investigó el efecto de cada tratamiento sobre las categorías funcionales, así como los relacionadas con virulencia, enfermedad y defensas en función de los niveles de consistencia-dpw (Gráficas 6 y 7).
El análisis del nivel funcional SF2 reveló la categoría “Resistencia a antibióticos”y “Compuestos tóxicos”asociada con los tratamientos ZnO y Ct en las muestras fecales a los 14 dpw y de diarrea a los 7 dpw, respectivamente.
El análisis detallado de las funciones de la categoría “Virulencia, enfermedad y defensas” en el nivel funcional SF3 reveló vínculos con mecanismos específicos de resistencia antimicrobiana dependiendo de cada nivel de consistencia-dpw, relacionándose la resistencia a cobalto, zinc y cadmio específicamente al grupo ZnO (Gráfica 7).
Las funciones asociadas al grupo Ct estaban relacionadas con mecanismos de virulencia de microorganismos Gram-negativos, adhesión y colonización, mientras que en el grupo Ab se encontraron mecanismos relacionados con la adhesión y multirresistencia antibiótica (Gráfica 7).
GRÁFICA 6. Diferencias en los niveles funcionales SF1 (A-C) y SF2 (D-F). Categorías funcionales SF1 asociadas con cada tratamiento dietético en el análisis de Fecal_7dpw (A), en el análisis de Diarrea_7dpw (B) y en el análisis de Fecal_14dpw (C). Categorías funcionales SF2 asociadas a cada tratamiento dietético el análisis de Fecal_7dpw (D) y en el análisis de Diarrea_7dpw (E) y en el análisis de Fecal_14dpw (F).
GRÁFICA 7. Diferencias en las funciones relacionadas con Virulencia, Enfermedad y Defensas del nivel SF3. Categorías funcionales SF3 relacionadas con la virulencia asociadas con cada tratamiento dietético en el análisis de Fecal_7dpw (A), en el análisis de Diarrea_7dpw (B) y en el análisis de Fecal_14dpw (C).
DISCUSIÓN
Los tratamientos con ZnO y Ab en la alimentación se han utilizado ampliamente para prevenir y controlar la DPD, pero la contaminación ambiental y la resistencia a los antimicrobianos hacen necesario encontrar nuevos enfoques para su control.
En este contexto, se está prestando cada vez más atención al impacto del destete y de los tratamientos para evitar la DPD en la composición y funcionalidad de la microbiota5.
La caracterización detallada de la microbiota en heces normales y diarreicas de lechones con o sin tratamientos terapéuticos proporcionará conocimientos para desarrollar una microbiota más resistente, buscando rasgos taxonómicos (especies microbianas) y funcionales relacionados con la resistencia/aparición de la DPD.
TRANSICIÓN POSTDESTETE
LA RIQUEZA Y DIVERSIDAD DE LA MICROBIOTA AUMENTA A PARTIR DEL DESTETE, ESTANDO RELACIONADA CON LA DIETA Y LA EDAD DE LOS ANIMALES9,40,41
En este estudio, observamos un desplazamiento de la dominancia microbiana en los primeros 14 dpw, independientemente del tratamiento terapéutico utilizado.
Los valores más bajos observados, tanto a nivel taxonómico como funcional, en los índices de uniformidad señalan que el tratamiento con ZnO genera rápidamente una jerarquía en la composición de la microbiota en comparación con los animales no medicados o medicados con Ab.
Al examinar los rasgos taxonómicos hubo una diferenciación de las muestras en dos ramas principales, definidas por el momento del muestreo y la abundancia relativa de las especies.
La transición de una microbiota orientada a la leche (clúster 3) a una dominada por bacterias degradadoras de fibra (clúster 2) demuestra el cambio en la composición de la microbiota en esta etapa (Gráfica 3).
La evolución de la composición microbiana postdestete siguió una trayectoria diferente en función del tratamiento dietético, manteniéndose algunas especies con una abundancia relativa similar a lo largo de los días y tratamientos como F. prausnitzii, L. reuteri, P. ruminicola, P. denticola, E. rectale y algunas especies propias de cada tratamiento en cada día postdestete.
En el momento del destete (0 dpw), antes de aplicar cualquier tratamiento, la abundancia relativa de especies era prácticamente la misma en todos los tratamientos, lo que refleja la elevada uniformidad en la composición de especies observada en el análisis de diversidad alfa.
Los patrones de abundancia relativa funcional reflejaron una composición estable a lo largo de las 2 semanas del estudio, lo que evidencia la capacidad de la microbiota para mantener un conjunto necesario de funciones a pesar de la sucesión de especies, la fluctuación de abundancias en los distintos puntos temporales y de otras perturbaciones, como la aplicación de tratamientos. Estos conceptos se conocen como resiliencia y redundancia funcional15,16.
En cuanto a las especies asociadas a cada tratamiento dietético, las especies que mostraron consistencia a lo largo del periodo postdestete fueron las pertenecientes al filo Pseudomonadota en el grupo Ct y especies pertenecientes a la familia Bacteroidaceae y Clostridioides difficile en el grupo ZnO.
COMPOSICIÓN DE LA MICROBIOTA EN MUESTRAS DIARREICAS Y PAPEL DE LOS AB Y ZNO EN LA DISMINUCIÓN DE LAS ALTERACIONES POSTDESTETE
En este estudio, se exploraron los efectos de los tratamientos sobre la composición y funcionalidad de la microbiota en muestras diarreicas, encontrando grandes diferencias entre los tratamientos.
La ordenación de las muestras reveló una diferencia notable entre las muestras diarreicas y las muestras fecales (Gráfica 2). No obstante, la composición de las muestras diarreicas de los grupos Ab y ZnO estaban más próximas a las de los animales sanos, lo que podría sugerir que revierten la composición y funcionalidad de la microbiota a su estado normal.
Tanto los Ab como el ZnO impidieron el sobrecrecimiento de E. coli, tanto en muestras sanas como diarreicas a los 7 dpw, lo que podría explicar por qué, en su ausencia, la DPD puede resultar en un desequilibrio dominado por esta bacteria.
El análisis funcional de las muestras diarreicas en los tres grupos reveló que las ligeras diferencias vistas en la categoría de “Virulencia, enfermedad, y defensas” en la comunidad microbiana del grupo Ct ejercen una gran influencia en la composición de especies y la homeostasis del hospedador, lo que explica las diferencias que subyacen al cuadro clínico de la diarrea.
Una mayor abundancia de funciones como adquisición y metabolismo del hierro, profagos, elementos transponibles, virulencia, enfermedad y defensas podrían ser indicativos de un estado microbiano inestable en las muestras fecal_7dpw y diarrea_7dpw en el grupo Ct.
El metabolismo del azufre estaba más presente en el grupo ZnO en las muestras Fecal_7dpw y Diarrea_7dpw, así como el metabolismo del ADN, la regulación transcripcional y la latencia y esporulación en las muestras Diarrea_7dpw.
Una mayor abundancia de esta última categoría podría sugerir la adaptación bacteriana a las condiciones desfavorables generadas por el estado de disbiosis intestinal, los efectos del ZnO en el intestino, o ambos.
LAS MUESTRAS DEL GRUPO ZNO A LOS 14DPW SE RELACIONARON CON FUNCIONES ASOCIADAS A LOS METALES (RESISTENCIA AL ZINC, COBALTO Y CADMIO) Y A LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Los resultados de este estudio demuestran que la microbiota intestinal de los lechones se adapta al destete, cambiando rápidamente durante las dos primeras semanas postdestete y la diarrea modifica notablemente esta adaptación.
La medicación en el pienso, ya sea con antibióticos o con ZnO, también modula la transición de especies y la riqueza funcional, la diversidad y la composición de la microbiota observadas en este periodo.
Si bien, ambas estrategias terapéuticas inhiben el sobrecrecimiento de E. coli, el uso de Ab favorece la colonización por la familia Veillonelaceae, mientras que el uso de ZnO parece ejercer el efecto contrario, dando ventaja a especies de las familias Tannerellaceae y Bacteroidaceae. Estos efectos son mucho más evidentes cuando se analizan animales con diarrea clínica, un resultado no descrito con tanto detalle hasta la fecha.
Estos resultados permiten mapear la microbiota de los lechones en el momento del destete y pueden ser útiles para encontrar alternativas a los compuestos antimicrobianos para mantener o restaurar el equilibrio microbiano en los momentos más críticos del postdestete.
Traducido y adaptado de: Ortiz Sanjuán, J.M., Argüello, H., Cabrera-Rubio, R. et al. Effects of removing in-feed antibiotics and zinc oxide on the taxonomy and functionality of the microbiota in post weaning pigs. anim microbiome 6, 18 (2024). https://doi.org/10.1186/s42523-024-00306-7 (CC BY 4.0).
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