Diagnóstico de enfermedades entéricas – Siempre paso a paso

El diagnóstico: paso a paso

El diagnóstico es un proceso que requiere ser metódico, siendo necesarios ciertos pasos para que sea certero.

Desde luego, no podemos olvidar que en primer lugar se debe hacer un buen diagnóstico clínico apoyado en un histórico (si lo tuviéramos) y una buena anamnesis.

Posteriormente, seguiremos con un diagnóstico anatomopatológico macroscópico presuntivo, ya que por desgracia, solemos tener bajas que nos brindan la oportunidad de hacer necropsias de campo que nos orienten en un sentido u otro.

Y después….se hará todo los demás.

No es infrecuente ver cómo se envían muestras para hacer diagnóstico molecular sin haber hecho siquiera una histopatología o incluso unas necropsias de campo.

Toma de muestras: crítico para el éxito de la prueba

Muestras de tejidos fijados

  ¿Cómo se fija una muestra de tejido para un diagnóstico de enfermedades entéricas?  

Elección de la muestra

Debemos tener siempre en cuenta que el tejido gastrointestinal se degrada muy rápidamente después de la muerte del animal, debido a la gran cantidad de enzimas, ácidos y bacterias que comienzan el proceso de degradación inmediatamente tras la muerte.

Elegir animales que no sabemos el tiempo que llevan muertos, suele ser una mala idea, ya que al final los tejidos estarán autolíticos y no servirán para hacer un buen diagnóstico histopatológico.

Por eso, en el caso de estas enfermedades, es recomendable sacrificar animales in situ en el momento de tomar las muestras y fijar los tejidos, sabiendo que no han pasado más que unos pocos minutos desde su muerte.

Fijación del tejido

Un punto importante es cómo fijar los tejidos, siendo esencial tener en cuenta la proporción de tejido/fijador.

Como mínimo, debe haber 5 veces el volumen de fijador por cada volumen de tejido, aunque lo ideal son 10 volúmenes de fijador por volumen de tejido.

Tomaremos una sección de 2-3 cm de longitud, lo abriremos longitudinalmente con una tijera, lo lavaremos muy suavemente con agua sin tocar la mucosa y lo introduciremos en el fijador. Esto nos asegura que la mucosa –que es donde más lesiones podemos ver– se va a fijar adecuadamente.

Errores frecuentes

Hay dos errores que se cometen con estas muestras que siempre debemos evitar:

 NUNCA podemos congelar una muestra para hacer histopatología: los cristales de hielo destruyen las células, impidiendo realizar el diagnóstico.

 NUNCA debemos ligar una sección de intestino para introducirla en el fijador: esto es adecuado para que no escape el contenido y hacer microbiología pero nunca para histopatología.

Heces

Las heces son otra de las muestras por excelencia en el diagnóstico de enfermedades entéricas, ya que la ruta de excreción-infección es oro-fecal, por lo que en algún momento, la mayoría de los patógenos estarán en las heces.

Las muestras de heces nunca deben tomarse del suelo de las cuadras, ya que corremos el riesgo de que estén contaminadas con patógenos que estuvieran en el suelo y no en las heces.

Las muestras de heces las tomaremos directamente del ano, con estimulación digital para obtener muestras en frasco estéril o mediante hisopos, con o sin medio de conservación y transporte.

Tejidos frescos

Los tejidos frescos serán la otra muestra clave en estas enfermedades, ya que nos proporcionarán el material necesario para las pruebas de biología molecular (PCR o q-PCR, por ejemplo).

De nuevo hay que tener en cuenta que la degradación de los tejidos puede conllevar la destrucción de ciertos patógenos o de los ácidos nucleicos de estos.

 Cuanto más fresco sea el tejido, mejor será para la obtención de ADN y ARN.

Siempre existe la controversia sobre congelar o no estas muestras.

Lo recomendable es NO congelarlas, pero en caso de necesidad, no es un factor invalidante como en el caso de la histopatología.

Pruebas complementarias

 Histopatología

Empecemos por la prueba más útil de todas las complementarias.

La histopatología es una de las herramientas fundamentales en el diagnóstico de la mayoría de las enfermedades ya que es muy sensible. Cualquier enfermedad es el resultado de la alteración de un tejido, pudiendo detectarse esos de forma muy precoz.

Por el contrario, es una técnica inespecífica, dado que diversas enfermedades pueden dar lugar a las mismas lesiones.

Desafortunadamente, es una de las técnicas de apoyo al diagnóstico que menos se usa. O no se usa bien.

Tinciones específicas e Inmunohistoquímica

Además de la histopatología, con los tejidos fijados en formol, podemos utilizar otras técnicas complementarias como las tinciones específicas y la inmunocitoquímica.

Tinciones específicas

Un ejemplo del uso de tinciones específicas, sería la evidenciación de bacterias como Brachyspira sp. o Lawsonia intracellularis. Podremos usar tinciones de plata con Warthin-Starry o mediante carbolfucsina.

Inmunocitoquímica

Con respecto a inmunocitoquímica, se utilizará un anticuerpo con una molécula cromógena para determinar la presencia de antígenos de algún patógeno, como también sería el caso de L. intracellularis o PCV2 (que puede participar en enfermedades entéricas).

 En este caso, podremos ver el antígeno asociado a las lesiones o descartar que el antígeno esté en células diana que se hayan movido hasta el intestino. Por ejemplo, PCV2 puede estar en el interior de células presentadoras de antígeno que hayan llegado al intestino desde otros órganos, pero que no tengan ninguna relación con la enfermedad que acontece.

Biología molecular. Más de moda que nunca

Dentro de las pruebas complementarias, en los últimos años, la biología molecular se ha convertido en una de las estrellas.

De hecho, en muchas ocasiones los clínicos de campo obvian los pasos anteriores y se lanzan directamente a intentar obtener resultados de una PCR o PCR en tiempo real.

No cabe duda de que estas pruebas son muy útiles desde el momento que nos dicen que el ARN o el ADN de un patógeno está en la muestras, pero tiene sus limitaciones obvias.

La más importante es que no nos permite relacionar lesiones con la presencia de dicho patógeno (mientras que la inmunocitoquímica sí lo hace). Muchas veces la PCR solo nos indica presencia/ausencia de un patógeno, pero en el caso de presencia no siempre es el causante de la enfermedad.

En este caso, la mera presencia del patógeno no es indicadora, pero podremos determinar si tiene factores de virulencia y si potencialmente produce el problema que nos ocupe.

Por ejemplo: la presencia de E. coli va a ser muy frecuente en las muestras de heces, pero esto no significa que esta bacteria esté involucrada en todos los problemas gastroentéricos que tengamos.

Otro de los problemas de esta técnica es que muchos patógenos pueden tener una excreción intermitente.

Por ejemplo, en animales infectados por L. intracellularis, la excreción no es constante y la obtención de un resultado negativo se puede deber a que se ha obtenido la muestra en una fase de no excreción.

Bacteriología. ¿Desplazada por la biología molecular?

Una realidad es que la bacteriología está siendo cada vez más desplazada por la biología molecular.

Muchos de los patógenos entéricos son difíciles de aislar y, por tanto, es preferible hacer una PCR y encontrar su ácido nucleico que hacerlos crecer en el laboratorio. Aun así, sigue siendo extremadamente útil, sobre todo porque nos permite hacer antibiogramas, algo cada vez más exigible para usar antibióticos.

 Nos hemos acostumbrado a hacer los diagnósticos sin seguir los pasos lógicos y esto hace que en ocasiones erremos en los resultados.

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