Diagnostico de influenza porcina

Por este motivo, son las proteínas más importantes y las que se emplean para clasificar a los virus de la Influenza en sus distintos subtipos.

En porcino los principales subtipos son el H1N1, H1N2 y H3N2, con baja reacción cruzada entre ellos. Sin embargo, el tema se complica, porque dentro de la H1, tenemos distintas variantes en función de su origen (aviar, humano o pandémico).

• La HA del H1N1 que circula en Europa es de origen aviar, por lo que se denomina H1avN1.
• Sin embargo, la HA del H1N2 es de origen humano (H1huN2).
• En el año 2009 se generó un nuevo virus H1N1 que provocó una pandemia a nivel humano. Este virus se denomina H1panN1 y se ha introducido en la cabaña porcina.

Aunque estas 3 HA pertenecen al mismo grupo (H1), existe poca reacción cruzada entre ellas. Por este motivo es clave identificarlas al realizar un diagnóstico.

En cuanto al resultado, saber que la hemaglutinina del AIV es H1 no nos aporta la información completa del virus ; debemos saber si es un H1av, H1hu o H1pan.

Aparición de nuevos subtipos mediante reordenación.

Para acabar de rizar el rizo, los distintos subtipos de AIV pueden reordenarse entre sí cuando 2 virus de subtipos distintos coinfectan a una misma célula al mismo tiempo.

De esta forma podemos, por ejemplo diagnosticar un H1panN2 debido a la reordenación entre un H1panN1 y un H3huN2 o un H1huN2. Así pues, las combinaciones son múltiples y no se restringen únicamente a los 3 subtipos clásicos.

Ahora bien, una vacuna que cubra los 4 principales subtipos, cubre todas sus reordenaciónes entre sí.

Diagnóstico: Detección directa del virus

Toma de muestras

AIV es detectable poco tiempo después de la aparición de la sintomatología (3-5 días) y exclusivamente en el aparato respiratorio (no produce viremia), por lo que el virus nunca es detectable en sangre.

Debido al corto periodo de excreción, para detectar el virus, es importante restringir la toma de muestras a animales con síntomas agudos claros: fiebre alta (>39,5 ºC, o incluso más en cerdas), inanición, letargia, lagrimeo, respiración abdominal y tos.

En algunos casos puede asociarse a abortos o repeticiones acíclicas en cerdas.

Debemos tener en cuenta que al contrario de lo que sucedía hace unos años, AIV se presenta cada vez más de forma endémica, con infecciones recurrentes dentro de la población y con síntomas menos evidentes y afectando a menos animales a la vez.

Para la detección del agente se pueden usar distintas muestras:

1. Hisopo nasal
2. Lavado traqueobronquial
3. Pulmón refrigerado
4. Fluidos orales (cuerdas)

La ventaja de las 3 primeras es que vinculan claramente la sintomatología con la enfermedad.

Debido al corto periodo de excreción, la detección del virus en animales individuales con síntomas es muy indicativa de la participación de AIV en el proceso patológico.

Son técnicas muy útiles cuando tenemos animales con síntomas claros (aunque sean pocos).

El lavado traqueobronquial (LTB) presenta la ventaja de poder ampliar el panel diagnóstico a un mayor número de agentes en relación a los hisopos; y en relación a los pulmones, que no necesitamos tener bajas.

Los fluidos orales ofrecen la comodidad de valorar la presencia de virus en varios animales con una sola muestra, lo que es muy útil cuando la prevalencia es baja y los síntomas poco claros.

Sin embargo no siempre establecen un vínculo claro entre síntomatología y enfermedad, por lo que principalmente son útiles para monitorizar animales o granjas.

Por ejemplo, podemos tener procesos en que varios animales se retrasan, coincidiendo con cuerdas positivas a AIV. Sin embargo, no tenemos la seguridad de si el motivo es AIV u otro proceso concomitante (por ejemplo, Glässer). Sin embargo, cuando tomamos muestras individuales de animales afectados con hisopos o LTB y detectamos que una cierta proporción es positiva, el vínculo parece mucho más claro.

Además, los fluidos orales tienen menor carga viral porque AIV está en menor concentración en cavidad oral y además es una muestra más frágil porque contiene inhibidores del virus (sales, enzimas, bacterias) que pueden afectar a su detección por RT-PCR.

Otro problema es que los animales adultos (como las cerdas) suelen prestar poca atención a las cuerdas, por lo que es una técnica aconsejable únicamente en animales jóvenes.

Todas las muestras para detección directa de AIV deben mantenerse en refrigeración (4ºC) y realizar el envío al laboratorio rápidamente. En el caso de los fluidos orales, estas medidas se deben extremar.

La refrigeración debe mantenerse desde el momento de la obtención e incluso es recomendable centrifugar y decantar la muestra obtenida.

Técnicas laboratoriales de detección directa: PCR

El diagnóstico mediante PCR permite detectar en un primer paso la presencia de AIV mediante la identificación de genes que codifican para las nucleoproteínas (M/NP) y en caso positivo subtipar en un segundo paso a partir de una PCR dirigida a la HA y NA.

Algunos laboratorios también disponen de RT-qPCR capaces de determinar el origen de la HA (humana o aviar).

El siguiente ejemplo es positivo a H1avN2 (fruto de una reordenación entre H1avN1 y H1huN2 o H3huN2).

La identificación del origen de las H1 permite determinar si el subtipo presente es pandémico, algo fundamental, puesto que las vacunas registradas hoy en día ofrecen una baja protección frente al AIV pandémico.

Posteriormente también es posible determinar la secuencia genética para realizar un análisis filogenético y conocer la evolución del virus o si se han introducido nuevos virus en la explotación.

Diagnóstico: Detección de anticuerpos frente a AIV

Toma de muestras

Los anticuerpos pueden ser detectables a partir de la primera semana post-infección, con un nivel máximo alrededor de las 2-3 semanas p.i., empiezan a disminuir alrededor de los 2 meses y pueden llegar a mantenerse hasta los 8-10 meses pos infección.

El estudio de la seroconversión es muy útil cuando es demasiado tarde para identificar el virus directamente (por ejemplo cuando ya hace una semana que empezaron los síntomas) y permite valorar otras enfermedades para realizar un diagnóstico diferencial.

El estudio de seroconversión en cerdas después de un aborto puede ser fundamental para el diagnóstico diferencial entre influenza, PRRS, mal rojo y leptospirosis, por ejemplo.

Aunque ofrece menos información, una única toma alrededor de las 2-3 semanas post infección nos puede permitir asociar la presencia de títulos altos con la aparición de un brote de AIV.

También nos puede permitir determinar el grado de homogeneidad de una población y usando la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación, los subtipos implicados.

Técnicas laboratoriales de detección de anticuerpos: ELISA / Inhibición de la Hemaglutinación

La técnica ELISA no diferencia entre los diferentes subtipos y algunos ELISA son solo cualitativos. Esto lleva a que en ocasiones sea difícil valorar seroconversiones porque en el primer muestreo los animales pueden ya ser positivos frente a subtipos que en ese momento no están involucrados en el proceso clínico de AIV que ha afectado a los animales.

La inhibición de la hemaglutinación (HI) diferencia los distintos subtipos (H1N1, H1N2, H3N2, e incluso las variedades pandémicas H1pdmN1 y H1pdmN2).

Sin embargo el grado de reacción depende de la similitud entre la cepa de referencia empleada en el diagnóstico y la presente en la muestra (cepa campo).

Además, en esta técnica existe cierta reacción cruzada entre los distintos subtipos, por lo que su interpretación puede complicarse en algunas situaciones.

Ejemplo de un resultado de Inhibición de la hemagkutinación en la que se valoran los 3 subtipos clásicos que afectan al cerdo, además de 2 subtipos pandémicos. Puesto que el subtipo H1avN1 es el que tiene mayor variabilidad, en este ejemplo se analizan 2 variantes distintas (tipo 1 y tipo 2).

Diagnóstico: Evaluación de lesiones pulmonares

En la necropsia de pulmones afectados por AIV se observa neumonía bronquiolo-intersticial.

El pulmón no se colapsa y se aprecia consolidación pulmonar concentrada en los lóbulos craneales mayoritariamente que es indiferenciables de la producida por Mycoplasma hyopneumoniae.

Las lesiones también pueden mostrar el típico patrón en tablero de ajedrez. Sin embargo, la contaminación con agentes secundarios suele complicar la observación de lesiones.

La Histopatología permite la observación de lesiones características de AIV: necrosis del epitelio de las vías respiratorias (bronquiolitis necropurulenta).

Estas lesiones, asociadas a la detección del virus mediante PCR o inmunohistoquímica, establecen un diagnóstico claro y permiten realizar un buen diagnóstico diferencial de otros agentes causantes de problemas respiratorios.

CONCLUSIÓN

• AIV no es una enfermedad simple de diagnosticar porque el virus se elimina rápidamente.
• Esto obliga a invertir un cierto tiempo en la selección de los animales a muestrear y en ocasiones a repetir muestreos con resultados negativos.
• Sin embargo, por el mismo motivo, cuando los resultados son positivos en una cierta proporción de los animales con síntomas, la implicación de AIV en el proceso patológico es muy probable.
• En ocasiones, es necesario combinar varias técnicas, detectando el virus y comprobando la seroconversión de los animales afectados.