Diagnóstico molecular del PRRS: de la PCR a tiempo real a la secuenciación masiva

LA GRAN VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PRRSV ES FRUTO DE SU ELEVADA TASA DE MUTACIÓN Y DE LOS FENÓMENOS DE RECOMBINACIÓN

En un animal infectado, lo habitual es que se encuentre un conjunto de cuasiespecies virales sobre las que actúa la presión selectiva derivada de la inmunidad del hospedador^9,10. Todo ello ha conducido al extenso abanico de cepas circulantes PRRS en todo el mundo¹¹.

DIAGNÓSTICO DE PRRS

El grave impacto productivo derivado del PRRS ha hecho que, desde su descubrimiento a finales de los años ochenta, el virus siga siendo objeto de numerosas investigaciones con el objetivo de entender los mecanismos que intervienen en su patogénesis y epidemiología, así como desarrollar estrategias para el control efectivo de la enfermedad.

Para esto último, las medidas de bioseguridad, el manejo, la inmunización y el diagnóstico temprano son aspectos claves^12,13.

  TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Y CULTIVO VIRAL  

El uso de técnicas serológicas es común para la detección de anticuerpos frente al virus, aunque no permiten diferenciar anticuerpos de infecciones activas de los producidos como respuesta a la vacunación.

Además, los resultados negativos no pueden descartar una infección, ya que en procesos agudos puede no haberse producido la seroconversión en el momento del análisis y la respuesta inmunitaria puede ser muy variable.

Por otro lado, a pesar de la complejidad y el largo tiempo de análisis, el aislamiento y cultivo viral también se han empleado como método de diagnóstico. Además, técnicas como la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia permiten detectar el antígeno viral pero su sensibilidad es limitada¹⁴.

  TÉCNICAS MOLECULARES  

Las técnicas moleculares basadas en la detección del genoma viral, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), confieren gran sensibilidad y especificidad¹⁵.

Requieren de [registrados]un menor tiempo de análisis, lo que resulta clave en ciertas aplicaciones como descartar la presencia del virus en dosis seminales de forma previa a la inseminación⁶.

LA PCR ES LA HERRAMIENTA MÁS UTILIZADA EN LA ACTUALIDAD Y PERMITE ANALIZAR VARIOS TIPOS DE MUESTRAS DIFERENTES

La elección del tipo de muestra dependerá del objetivo del análisis:

PCR A TIEMPO REAL

La PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR) es actualmente la técnica más extendida entre los laboratorios veterinarios para realizar el diagnóstico y monitorización de patógenos, incluido el PRRSV.

Aunque la PCR convencional con retrotranscripción o transcripción inversa (RT-PCR) ya se utilizaba para el diagnóstico de PRRSV21, la qPCR, llevando a cabo el paso previo necesario de retrotranscripción del genoma ARN del virus (RT-qPCR), ha terminado por reemplazarla, ya que presenta importantes ventajas:

Reducción del tiempo de análisis y de la probabilidad de obtener falsos positivos (la PCR convencional requiere de un análisis post- PCR del fragmento amplificado de ADN, lo que aumenta el riesgo de contaminación de otras muestras).

Aumento de la sensibilidad y especificidad, y obtención de información cuantitativa²¹.

Al igual que la PCR convencional, la qPCR consiste en la amplificación de un fragmento del genoma utilizando un par de oligonucleótidos, llamados cebadores, que son complementarios a dicha región. En la qPCR, este fragmento se detecta por fluorescencia tras cada ciclo (en “tiempo real”).

Para ello, se pueden emplear agentes que se intercalan en el ADN de doble cadena y emiten fluorescencia o mediante un tercer oligonucleótido (sonda) que está marcado con una molécula fluorescente que emite luz cuando la secuencia diana está presente (Figura 2)²².

La gran diferencia a nivel genómico entre los genotipos I y II posibilita su detección específica en una única reacción de RT-qPCR utilizando diferentes parejas de cebadores y sondas marcadas con moléculas fluorescentes distintas. Del mismo modo puede incorporarse la detección adicional de controles internos.

El uso de estos controles consiste en la adición de un fragmento de ARN o ADN a la muestra clínica de forma previa a la extracción, y que luego es detectado en la qPCR. Permite verificar el proceso de extracción, la reacción de amplificación y la ausencia de inhibidores, evitando así resultados falso-negativos (Figura 3)²³.

La capacidad de esta técnica para identificar regiones genómicas concretas ha permitido el diseño de ensayos específicos para detectar cepas de alta patogenicidad o virulencia.

Por ejemplo, se han diseñado ensayos de RT-qPCR para detectar algunas cepas de este tipo descritas en China y caracterizadas por carecer de determinados segmentos (lo que se conoce como deleciones) en el ORF1a^23,24.

Considerando que las estrategias de prevención se basan en gran parte en la vacunación con cepas vivas atenuadas²⁵ y que los kits comerciales para la detección de PRRSV no diferencian entre cepas vacunales y cepas campo, es importante conocer si un resultado qPCR positivo se debe a la presencia de una cepa vacunal para poder tomar las medidas de manejo apropiadas.

En este sentido, hay trabajos en los que se han desarrollado ensayos de qPCR para la detección de cepas vacunales²⁶ y ya existen kits comerciales para este fin.

SECUENCIACIÓN DE SANGER

La secuenciación de Sanger es una metodología que consiste en la determinación de los nucleótidos que conforman una región de ADN. Permite obtener secuencias de hasta 900-1000 pares de bases, lo que resulta muy útil para secuenciar genes o secuencias cortas.

LA SECUENCIACIÓN DE SANGER DEL VIRUS PRRS, EN CONCRETO DEL ORF5, ES UN ANÁLISIS DE RUTINA EN LA MAYORÍA DE LOS LABORATORIOS VETERINARIOS

ORF5

El ORF5, de una longitud de 606 bp, contiene regiones inmunogénicas y regiones hipervariables que posibilitan una discriminación entre las diferentes cepas²⁷.

Para obtener su secuencia, se realiza una RT-PCR utilizando parejas de cebadores que se unen a las zonas flanqueantes del ORF, amplificando esa región y consiguiendo un número elevado de copias para el posterior paso de secuenciación. No obstante, no todas las muestras positivas a PRRS por PCR a tiempo real son susceptibles de ser secuenciadas, ya que muestras con títulos bajos (Cq superiores a 30) disminuyen las probabilidades de éxito en la obtención de una secuencia de buena calidad.

Una vez obtenida la secuencia final, es posible compararla con las secuencias ORF5 de las cepas vacunales o con otras cepas secuenciadas previamente en la misma explotación o pirámide productiva (Figura 4A y B).

Si bien, se trata de un valor arbitrario, está generalmente aceptado un cut-off de 97% de similitud en la secuencia de nucleótidos para el ORF5 para determinar que con alta probabilidad se trate de la misma cepa. No obstante, para llegar a esta conclusión, es importante considerar:

• La ubicación geográfica de estas dos cepas.
• El periodo de tiempo en el que se han detectado.

¿Qué nos dicen los resultados de la secuenciación de Sanger sobre la bioseguridad de la granja?

De esta forma se podrán tomar las acciones correctivas más apropiadas
para disminuir las probabilidades de transmisión del virus.

ANÁLISIS FILOGENÉTICOS

Si la secuenciación se realiza de forma rutinaria y se dispone de secuencias a lo largo del tiempo y de una región geográfica, el análisis de las relaciones filogenéticas entre ellas da una imagen muy útil de la situación epidemiológica del virus en un área y su progresión y transmisión en un periodo de tiempo determinado (Figura 4C).

Es cierto que la secuenciación de ORF5 proporciona una valiosa información epidemiológica y tiene aplicación directa en campo. Sin embargo, no se puede pasar por alto que esta región representa un 5% del genoma de PRRS por lo que no permite captar toda la variabilidad genética de una cepa (Figura 1)⁷.

En este punto, cabe destacar los fenómenos de recombinación que se han descrito para ambos genotipos de PRRS y que pueden ocurrir a lo largo de diversos puntos en todo el genoma, incluso dentro de un mismo ORF.

Estos eventos de recombinación generan cepas quimera que contienen secuencias de diferentes cepas parentales. Ocurren cuando dos o más cepas de PRRSV infectan una misma célula de forma simultánea⁵. Por ejemplo, se han descrito cepas de campo que contienen el ORF5 procedente de cepas vacunales vivas atenuadas, por lo que se podrían clasificar cepas como vacunales cuando en realidad no lo son²⁸.

Además, ante una infección por una cepa recombinante se puede realizar una asunción errónea de una recirculación si esta comparte una alta similitud en ORF5 con otras cepas detectadas previamente.

LAS DISCREPANCIAS ENTRE EL DIAGNÓSTICO Y LOS SIGNOS CLÍNICOS OBSERVADOS PUEDEN SER UNA PISTA PARA SOSPECHAR DE UNA CEPA RECOMBINANTE²⁹

En estos casos, mediante secuenciación Sanger se pueden amplificar varios fragmentos del genoma que cubran una región más amplia (ORF2-5 u ORF2-7) o simplemente de otro ORF no adyacente al ORF5, por ejemplo, el ORF1a u ORF2, permitiendo identificar este tipo de cepas³⁰.

Finalmente, es importante conocer las limitaciones de la secuenciación Sanger:

El resultado de esta técnica es una única secuencia consenso, lo que significa que, con alta probabilidad, se obtiene la variante mayoritaria en la muestra e impide la observación del resto de mutantes presentes o, dentro de un mismo individuo, de las cuasiespecies, dificultando el estudio de la evolución del virus.

En muestras que contengan dos cepas diferentes puede no llegar a obtenerse una secuencia consenso final.

SECUENCIACIÓN MASIVA

Comúnmente denominada NGS (del inglés Next Generation Sequencing), la secuenciación masiva permite la obtención miles de secuencias cortas, unos 200- 300 pares de bases, de forma paralela.

Estos pequeños fragmentos se someten a un complejo análisis con herramientas bioinformáticas para armar un puzle llegando a obtener secuencias más largas o genomas completos en poco tiempo.

En comparación a la secuenciación de Sanger:

El proceso es menos laborioso.

El coste por nucleótido secuenciado es menor.

No es necesario un conocimiento previo del genoma del agente.

Recientemente, se han desarrollado nuevas tecnologías que ofrecen secuenciación de fragmentos mucho más largos (>10.000 pares de bases).

En su aplicación al estudio del PRRSV, la secuenciación masiva ha aumentado el número de genomas completos disponibles. Gracias a ello, se ha determinado que, aparte del ORF5, existen otras regiones con más variabilidad como el principio del ORF1a³¹.

CONOCER LA TOTALIDAD DEL GENOMA IMPLICA TENER UNA CEPA COMPLETAMENTE CARACTERIZADA Y ESTABLECER DE FORMA MUCHO MÁS PRECISA LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS ENTRE CEPAS

Con la secuenciación masiva no se obtiene una única secuencia como en la secuenciación de Sanger, sino que todo el material genético en una muestra, donde pueden encontrarse distintas variantes o mutantes de PRRSV, se secuencia (Figura 5A).

Por ello, si se realizara de forma rutinaria, se podría observar cómo se comporta o cómo varía la presencia de posibles variantes en una explotación en respuesta a condiciones concretas (por ejemplo, tras una campaña de vacunación)32. Por supuesto, también permitiría identificar muestras con una coinfección por dos cepas diferentes.

A nivel de investigación, con la secuenciación masiva se puede ahondar, entre otros, en:

• La diversidad genética y la evolución del virus.
• Las variaciones de las cepas circulantes a lo largo del tiempo.
• Los mecanismos de transmisión y evasión de la respuesta inmunitaria
• El conjunto de cuasiespecies virales en un individuo y su distribución en los diferentes tejidos.

El coste de la secuenciación masiva y el tiempo y dificultad de análisis son todavía una limitación en su uso como herramienta diagnóstica para el veterinario de campo. Además, la carga de PRRSV y el tipo de muestra pueden afectar al éxito de la secuenciación³⁴.

La variabilidad observada en los datos de secuenciación masiva es únicamente a nivel cualitativo por lo que no es posible obtener información cuantitativa, especialmente de aquellas variantes en menor proporción, que incluso podrían llegar a no detectarse³².

OTRAS HERRAMIENTAS PARA EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PRRS

La rapidez en el diagnóstico para aplicar medidas correctivas en el menor tiempo posible es clave ante un brote de una enfermedad y el PRRS no es una excepción.

Existen técnicas en desarrollo para hacer diagnósticos in-situ sin la necesidad de equipos especializados. Entre otros sistemas, la PCR isoterma y la amplificación por recombinasa se han descrito como posibles herramientas para detectar el virus PRRSV con buena sensibilidad y especificidad.

Son técnicas similares a una PCR, pero se realizan a temperatura constante, pudiendo observarse el resultado de forma visual -por ejemplo, con un cambio de color en el tubo de reacción o una tira de flujo lateral (similar a un test rápido)- y no requieren de equipamiento complejo ni personal altamente cualificado.

No obstante, para poder explotar su potencial todavía se debe optimizar su sensibilidad y su robustez para que su resultado llegue a ser comparable a la qPCR o poder usar muestras clínicas directas sin extracción previa de ácidos nucleicos^35,36.

Las últimas tecnologías de secuenciación desarrolladas (tercera generación) han conseguido ampliar la longitud de las secuencias obtenidas, así como poder secuenciar directamente moléculas ARN.

Una de estas tecnologías se basa en el uso de nanoporos (tecnología MiniON Oxford Nanopore) y se realiza con un pequeño dispositivo portable conectado a un ordenador (Figura 5B).

En estudios de PRRSV con este equipo se se ha demostrado que es posible secuenciar directamente la molécula ARN de su genoma en pocas horas y, aplicando un análisis bioinformático más sencillo, pueden obtenerse lecturas de secuencias más largas. Con este sistema también fue posible identificar coinfección de dos cepas en la misma muestra³⁷.

HAY QUE DESTACAR LA IMPORTANCIA DE REGISTRAR, ANALIZAR Y USAR TODA LA INFORMACIÓN QUE SE RECOPILA DE FORMA GLOBAL

Cada día, en los laboratorios veterinarios se realizan cientos de análisis moleculares de muchos patógenos, generando multitud de informes individuales. El análisis de la información diagnóstica desde una perspectiva global de una enfermedad como el PRRSV, incluso en combinación con otras enfermedades, proporciona información muy valiosa.

Con el fin de exprimir toda esta información, existen actualmente en algunos países bases de datos que agregan resultados de laboratorios privados junto con información pública para obtener información en nuevos patógenos emergentes y en su diseminación³⁸.

CONCLUSIONES

La RT-qPCR es una herramienta indispensable para el diagnóstico de PRRS de forma sensible y rápida ante un brote o como forma de monitorización. Sin embargo, debe ir de la mano de la secuenciación para proporcionar la información genética de la cepa detectada, indispensable para la toma de decisiones a nivel de granja.

ES IMPORTANTE QUE LA INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO DE SECUENCIACIÓN SE REALICE JUNTO CON LA OBSERVACIÓN CLÍNICA Y LA SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE LA EXPLOTACIÓN O LA REGIÓN

El seguimiento epidemiológico basado en la secuenciación de ORF5 resulta de gran utilidad, pero la secuenciación de otras regiones más amplias u ORFs no contiguos puede ampliar la información obtenida y confirmar presencia de cepas recombinantes.

La secuenciación masiva podrá en el futuro reemplazar a la secuenciación de ORFs individuales, brindando mucha más información y proporcionando una caracterización genética completa.

Asimismo, el desarrollo y la optimización de las nuevas tecnologías surgidas podrán ofrecer un diagnóstico más rápido y a pie de granja, algunas de ellas aportando información genética en tiempo real.

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